长链非编码RNA MBNL1-AS1对舌鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响

蒋冰坤，李 丽

舌鳞状细胞癌(TSCC)是最常见的口腔癌类型，占全世界口腔癌的25%～40%[1-2]。由于TSCC的高增殖与高转移能力，已严重威胁人类健康[3]。由于缺乏癌变症状，大多数TSCC患者确诊时已处于晚期。长链非编码RNA(lncRNA)与癌症、慢性代谢性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病等多种人类疾病密切相关。lncRNA MBNL1-AS1与急性髓系白血病预后相关，其低表达是患者预后不良的独立因素[4]。在膀胱癌中，lncRNA MBNL1-AS1发挥抑癌作用，其低表达与膀胱癌进展有关[5]。lncRNA MBNL1-AS1可抑制非小细胞肺癌肿瘤干细胞增殖、迁移、侵袭、耐药和球体形成[6]。但lncRNA MBNL1-AS1在TSCC中的表达及作用未见报道，生物信息学软件预测显示lncRNA MBNL1-AS1与miR-503-5p具有结合位点。研究报道，TSCC组织和细胞中miR-503-5p呈高表达，miR-503-5p过表达可逆转上调lncRNA PART1对TSCC细胞凋亡的促进作用及对细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用[7]。尽管miR-503-5p在TSCC中的作用已有报道，但是lncRNA MBNL1-AS1可否通过调控miR-503-5p表达来影响TSCC进展还尚未可知。故本实验旨在研究lncRNA MBNL1-AS1能否通过靶向调控miR-503-5p表达来影响TSCC CAL-27细胞增殖和凋亡。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取我院2017年3月—2019年3月30例TSCC的癌组织及癌旁组织，手术切除后立即将样本保存于-80 ℃环境中。

1.2细胞与试剂 TSCC CAL-27细胞购自上海雅吉生物科技有限公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；胰蛋白酶、Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；Trziol、逆转录、qRT-PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；MTT试剂购自上海晶抗生物工程有限公司；RIPA蛋白裂解液、BCA试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自上海泽叶生物科技有限公司。

1.3细胞处理与分组 37 ℃、5% CO2条件下，在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养CAL-27细胞。分别将pcDNA、pcDNA-MBNL1-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-503-5p转染至CAL-27细胞中培养24 h，记为pcDNA组、pcDNA-MBNL1-AS1组、anti-miR-503-5p组、anti-miR-503-5p组；将pcDNA-MBNL1-AS1分别与miR-NC、miR-503-5p共转染至CAL-27细胞中，记为pcDNA-MBNL1-AS1+miR-NC组、pcDNA-MBNL1-AS1+miR-503-5p组。

1.4qRT-PCR检测lncRNA MBNL1-AS1表达 采用qRT-PCR法提取组织和细胞总RNA，逆转录成cDNA，lncRNA MBNL1-AS1和miR-503-5p以GAPDH和U6为内参，相对表达量采用2ΔΔCt法计算。

1.5MTT法检测细胞活力 取各组CAL-27细胞(2.5×104/ml)，接种于96孔板(100 μl/L)中培养24、48、72 h后，每孔加MTT溶液20 μl，培养4 h弃上清，每孔加二甲基亚砜150 μl，室温震荡孵育5 min，酶标仪检测450 nm波长处吸光度(OD)值。

1.6Annexin V法检测细胞凋亡情况 收集各组CAL-27细胞，按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明检测细胞凋亡情况。PBS液漂洗细胞2次，结合缓冲液重悬后，加入Annexin V-FITC、碘化丙啶各5 μl，37 ℃孵育15 min后，应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7Western blot法检测相关蛋白表达情况 提取各组细胞总蛋白，BCA试剂盒定量。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂牛奶室温封闭，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，暗室中曝光显影，定影，用Quantity One软件检测各组CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax蛋白的相对表达水平。

1.8双荧光素酶报告基因实验 构建MBNL1-AS1荧光素酶表达载体WT-MBNL1-AS1和MUT-MBNL1-AS1，CAL-27细胞分别转染miR-NC(miR-NC组)和miR-503-5p(miR-503-5p组)至WT-MBNL1-AS1、MUT-MBNL1-AS1，按照双荧光素酶报告基因实验试剂盒说明检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1lncRNA MBNL1-AS1和miR-503-5p在TSCC组织中的表达 TSCC组织中lncRNA MBNL1-AS1和miR-503-5p的表达水平分别低于和高于癌旁组织(P<0.01)。见表1。

表1 lncRNA MBNL1-AS1和miR-503-5p在TSCC组织及癌旁组织中的表达

2.2lncRNA MBNL1-AS1过表达对CAL-27细胞增殖和凋亡的影响 CAL-27细胞转染pcDNA-MBNL1-AS1后，lncRNA MBNL1-AS1表达升高，表示pcDNA-MBNL1-AS1转染成功；OD值、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达降低，凋亡率、p21、Bax蛋白表达升高(P<0.01)。见图1、表2和表3。

表2 lncRNA MBNL1-AS1过表达对TSCC CAL-27细胞增殖和凋亡的影响

表3 lncRNA MBNL1-AS1过表达对TSCC CAL-27细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

图1 lncRNA MBNL1-AS1过表达对TSCC CAL-27细胞增殖和凋亡的影响

2.3lncRNA MBNL1-AS1靶向调控miR-503-5p的表达 StarBase预测显示lncRNA MBNL1-AS1与miR-503-5p之间含有互补的核苷酸序列。见图2。双荧光素酶报告基因实验显示，与转染miR-NC的WT-MBNL1-AS1比较，转染miR-503-5p的荧光素酶活性显著降低(P<0.01)，见表4；分别转染pcDNA、pcDNA-MBNL1-AS1、si-NC、si-MBNL1-AS1至CAL-27细胞，qRT-PCR检测miR-503-5p表达水平，miR-503-5p表达水平pcDNA组为1.01±0.08，pcDNA-MBNL1-AS1组为0.45±0.03，si-NC组为1.02±0.07，si-MBNL1-AS1组为2.95±0.28，pcDNA-MBNL1-AS1组miR-503-5p表达水平低于pcDNA组(P<0.05)，si-MBNL1-AS1组miR-503-5p表达水平高于si-NC组(P<0.05)。

表4 TSCC MBNL1-AS1表达的双荧光素酶报告基因实验结果

图2 lncRNA MBNL1-AS1与miR-503-5p互补核苷酸序列

2.4下调miR-503-5p对TSCC CAL-27细胞增殖和凋亡的影响 CAL-27细胞转染anti-miR-503-5p后，miR-503-5p表达水平降低(P<0.01)，表示anti-miR-503-5p转染成功；OD值、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达水平降低，凋亡率、p21、Bax蛋白表达水平升高(P<0.01)。见图3、表5和表6。

表5 下调miR-503-5p对TSCC CAL-27细胞增殖和凋亡的影响

表6 下调miR-503-5p对TSCC CAL-27细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

图3 下调miR-503-5p对TSCC CAL-27细胞增殖和凋亡的影响

2.5上调miR-503-5p表达逆转lncRNA MBNL1-AS1过表达对TSCC CAL-27细胞增殖和凋亡的影响 与CAL-27细胞共转染pcDNA-MBNL1-AS1、miR-503-5p后，miR-503-5p表达水平升高(P<0.05)；OD值、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达水平升高，凋亡率、p21、Bax蛋白表达水平降低(P<0.05)。见图4、图5、表7和表8。

表7 上调miR-503-5p表达逆转lncRNA MBNL1-AS1过表达对TSCC CAL-27细胞增殖和凋亡的影响

表8 上调miR-503-5p表达逆转lncRNA MBNL1-AS1过表达对TSCC CAL-27细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

图4 上调miR-503-5p表达逆转lncRNA MBNL1-AS1过表达对舌鳞状细胞癌CAL-27细胞凋亡的影响

图5 上调miR-503-5p表达逆转lncRNA MBNL1-AS1过表达对舌鳞状细胞癌CAL-27细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

3 讨论

研究发现，lncRNAs是染色质修饰、转录调控、选择性剪接及在转录或转录后水平与RNA和蛋白质复合物相互作用过程中的核心调节因子[8]。lncRNAs参与调节人类癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等恶性生物学行为。在前列腺癌组织和细胞中，lncRNA MBNL1-AS1显著下调，lncRNA MBNL1-AS1过表达通过靶向下调miR-181a-5p和调节PTEN/PI3K/AKT/mTOR途径抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，抑制前列腺癌进展[9]。上调miR-338-5p可逆转lncRNA MBNL1-AS1过表达对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖和迁移的抑制作用[10]。miR-362-5p由lncRNA MBNL1-AS1调控，并通过靶向QKI促进膀胱癌细胞增殖和生长[11]。lncRNA MBNL1-AS1通过靶向下调miR-135a-5p促进A549和H1975细胞凋亡[12]。lncRNA MBNL1-AS1通过调控miR-412-3p/MYL9轴降低结肠癌肿瘤干细胞的增殖、迁移和侵袭能力[13]。本实验结果显示，与癌旁组织比较，TSCC组织中lncRNA MBNL1-AS1表达水平显著降低，lncRNA MBNL1-AS1过表达显著降低CAL-27细胞的OD值及CyclinD1、Bcl-2蛋白表达水平，提高细胞凋亡率及p21、Bax蛋白表达水平，提示lncRNA MBNL1-AS1过表达可抑制CAL-27细胞增殖，促进细胞凋亡，与上述研究结果一致。

有研究表明，lncRNA MBNL1-AS1可作为竞争性内源RNA负调控相关miRNA表达，从而抑制肿瘤进展[13]。本实验StarBase预测显示，lncRNA MBNL1-AS1与miR-503-5p含有互补的核苷酸序列，双荧光素酶报告基因实验显示，在WT-MBNL1-AS1中，转染miR-503-5p的荧光素酶活性显著降低，且lncRNA MBNL1-AS1靶向负调控miR-503-5p表达。miR-503-5p参与多种癌症的发生和发展。在结肠癌细胞和组织中，miR-503-5p表达显著下调，其低表达与结肠癌TNM分期、分化程度和淋巴结转移显著相关，过表达可促进结肠癌细胞凋亡和G1期阻滞，抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭[14]。miR-503-5p下调促进了肝细胞癌细胞的迁移和侵袭，miR-503-5p过表达通过下调WEE1抑制肝细胞癌的上皮间充质转化(EMT)[15]。体外实验显示,上调miR-503-5p表达可抑制食管鳞状细胞癌细胞的生存、侵袭和迁移能力，增强细胞凋亡，体内实验显示其表达上调可抑制肿瘤的发生[16]。miR-503-5p可抑制宫颈癌细胞的增殖、转移和糖酵解过程，miR-503-5p抑制剂可改善敲除circ_0085616对宫颈癌细胞增殖、转移和糖酵解的抑制作用[17]。miR-503-5p可抑制人绒毛膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭[18]。miR-503-5p通过靶向调控E2F3抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭、迁移和EMT[19]。miR-503-5p过表达通过干扰Rb/E2F信号通路，可抑制膀胱癌细胞的增殖[20]。miR-503-5p过表达通过靶向下调碱性成纤维细胞生长因子，可抑制膀胱癌T24细胞的迁移、侵袭和EMT[21]。在大肠癌奥沙利铂耐药细胞中miR-503-5p表达上调，miR-503-5p过表达通过下调PUMA表达可促进大肠癌多药耐药[22]。本结果显示，与癌旁组织比较，癌组织中miR-503-5p表达水平显著升高，下调miR-503-5p表达可显著降低CAL-27细胞的OD值、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达水平，提高细胞凋亡率及p21、Bax蛋白表达水平，提示下调miR-503-5p表达可抑制CAL-27细胞增殖，促进细胞凋亡；上调miR-503-5p表达逆转了lncRNA MBNL1-AS1过表达对TSCC CAL-27细胞增殖和凋亡的影响，显著提高了CAL-27细胞的OD值及CyclinD1、Bcl-2蛋白表达水平，降低细胞凋亡率及p21、Bax蛋白表达水平，提示lncRNA MBNL1-AS1可能通过调控miR-503-5p表达来影响CAL-27细胞的增殖和凋亡，与上述研究结果相似。

综上，lncRNA MBNL1-AS1在TSCC组织中表达下调，lncRNA MBNL1-AS1过表达可能通过靶向下调miR-503-5p表达调控TSCC CAL-27细胞的增殖和凋亡，这意味着lncRNA MBNL1-AS1可能成为治疗TSCC的新靶点，其在体内的作用及分子作用机制还有待进一步研究。