辣椒素对AngⅡ诱导VSMC增殖迁移及DOCA-盐引起的高血压大鼠血管重构的影响

周 毅，王雪笠，黎炳护，朱艳霞，甄 宁，高利涛，刘 军，王 丽，智建霞，张莉莉

在高血压慢性病程中，各级动脉出现结构或功能改变，包括细胞增殖、迁移、调亡及基质成分的改变和重排等各种复杂动态过程，最终引起血管重构。高血压血管重构的早期事件和重要环节是血管平滑肌细胞(VSMC)的表型转化。高血压状态下脑动脉中膜VSMC发生表型转化，由正常的收缩表型(分化表型)转化为合成表型(去分化表型)，自身发生VSMC增殖和迁移引起中膜增厚，是造成管腔狭窄的主要原因[1]。脑动脉这种组成结构的改变使得毛细血管床灌注及脑血流量减少，最终引起脑卒中。辣椒中的活性成分辣椒素(Cap)已被证明对肥胖、糖尿病和心血管疾病有积极的治疗作用[2-3]。美国国家健康和营养调查Ⅲ的一项大规模、以人群为基础的前瞻性研究表明，经常食用辣椒与较低的病死率有关[4]。同样，意大利的一项基于人群的研究报告称，每天食用辣椒可以显著降低心脑血管相关死亡的发生率[5]。此外，Cap被证明可以减轻神经退行性疾病模型动物的行为缺陷，如减少异常的不自主运动，改善空间学习和记忆能力[6-7]。Cap能够通过AMPK/NF-κB信号通路，降低基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达来抑制食管鳞状细胞癌的迁移和侵袭。Cap贴剂能够治疗化疗诱导的周围神经病理性疼痛，不仅缓解了疼痛，还避免了中枢神经系统不良反应[8]。一项涉及10个对照研究及398名参与者的荟萃分析表明，膳食中补充Cap可降低血清总胆固醇水平[9]。本研究旨在探讨Cap是否能够抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导VSMC的增殖迁移，减轻醋酸去氧皮质酮(DOCA)-盐引起的大鼠血压升高，进而抑制高血压引起的颈动脉内膜增生。

1 材料与方法

1.1实验动物及材料 雄性WKY大鼠(SPF级，10周龄)，体质量200～250 g，购自陆军军医大学特色医学中心实验动物中心，实验动物许可证号[SYXK(军)2017-0058]。胎牛血清、DMEM培养基购自美国Gibco公司。胰酶细胞消化液购自江苏碧云天生物技术研究所。Cap、辣椒素抑制剂(CapZ)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)一抗购自英国Abcam公司。AngⅡ、DOCA购自美国Sigma公司。

1.2实验方法

1.2.1动物造模及分组：WKY大鼠使用10%水合氯醛麻醉，俯卧位固定在手术台上，左侧背部剪毛，备皮，使用碘伏严格消毒。沿脊柱外侧、肋骨下缘做一长2.0～2.5 cm切口，从腹后膜进入找到肾脏，暴露整个左侧肾脏，并游离肾蒂，切除左侧肾脏。消毒后缝合肌层和皮肤。肾脏切除后观察1周，然后将40只实验大鼠随机分为4组：对照组(Con组)，肩胛部皮下注射普通植物油，普通饲料喂养，正常饮水；模型组(DOCA组)，肩胛部皮下注射40 mg/kg DOCA油剂，饮水中加入1%氯化钠溶液和0.1%氯化钾溶液；DOCA+Cap组，在DOCA组基础上饲料中添加0.01% Cap；DOCA+Cap+CapZ组，在DOCA+Cap组基础上饲料中添加0.01% CapZ。

1.2.2细胞培养及分组：采用组织块贴壁法培养VSMC。取小鼠胸主动脉，用含青、链霉素的无菌PBS液浸洗，仔细剥除纤维层和外膜。纵行剖开血管使内膜面向上，用眼科弯剪轻刮2～3遍去除血管内皮细胞。更换培养皿，将血管中层组织剪切成1 mm3小块，接种于25 ml培养瓶中，组织块间隙约为0.5 cm，瓶内加入含20%胎牛血清的DMEM/高糖培养基，直立于37 ℃、5% CO2无菌恒温培养箱中培养2～4 h，待组织块紧贴瓶底后轻轻翻转培养瓶，使培养基浸没组织块，3 d后更换培养基。待组织块有细胞爬出，且足够传代后行第一次传代，后待细胞生长至瓶底面积80%～90%即可传代培养。传代至第三代时，应用α-SMA鉴定原代VSMC。

1.2.3MTT法观察VSMC增殖情况：将3×104/ml的细胞悬液种植在96孔板上。应用AngⅡ(100 nmol/L)、Cap(1 μmol/L)、CapZ(1 μmol/L)将细胞分为空白对照组、AngⅡ组、AngⅡ+Cap组、AngⅡ+Cap+CapZ组。然后细胞样品与20 μl MTT在37 ℃下孵育4 h, 200 μl DMSO充分混合细胞。用酶标仪(Bio-Rad, CA, USA)测定570 nm波长处吸光度。

1.2.4划痕实验观察VSMC迁移情况：取对数生长期细胞，接种于24孔培养板中，每组细胞设3个复孔。当细胞铺满培养板后，用移液器枪头沿培养板底部划“一”字形划痕单层培养细胞，以此计时，镜下记录初始划痕区的相对距离。吸除原有培养液，无血清培养液轻洗2次，洗掉去除的细胞，加入含有10%胎牛血清的培养液及各组对应的干预试剂继续培养24 h，倒置显微镜下记录划痕的宽度并照相。

1.2.5Western blot法检测相关蛋白水平：采用Western blot法检测增殖细胞核抗原(PCNA)和MMP-9蛋白水平。蛋白质样本取自原代培养VSMC。蛋白质样品经12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上用抗PCNA(1︰500)、抗MMP-9(1︰500)和抗β-肌动蛋白(1︰2000)一抗在4 ℃下孵育过夜。洗涤后，将PVDF膜与辣根过氧化物酶耦联的二抗在室温下孵育2 h，然后应用Gel Doc 2000成像仪(美国CA Bio-Rad)采用密度法定量蛋白水平，以β-actin为正常对照。

1.2.6血压测定：在大鼠清醒状态下，使用智能无创鼠尾血压测定仪测量各组大鼠鼠尾收缩压(SBP)，每周测量1次。测量时首先将大鼠固定在合适的固定笼中，放置在37 ℃恒温加热架上预热5～10 min，使鼠尾血管充分扩张以便感应器感应。然后将鼠尾套在血压测量感应器压套上，压力传感器达鼠尾近心端约1/4处时固定传感器和大鼠。待大鼠充分安静后，打开血压检测系统，获取血压波形，并用软件记录。每次测量间隔2 min，每只大鼠重复测量5次，取平均值。

1.2.7HE染色观察颈动脉内膜增生情况：应用10%水合氯醛麻醉实验大鼠后以4%多聚甲醛溶液灌注固定，灌注结束后取大鼠颈动脉，置于4%多聚甲醛溶液中在4 ℃冰箱中固定24 h。灌注固定血管石蜡包埋，切片厚度6 μm，采用HE染色分析测量外弹性层(EEL)内面积、内弹力层(IEL)内面积和管腔面积。内膜面积=IEL内面积-管腔面积，EEL和IEL之间为中膜面积，通过计算内膜与中膜面积的比值来评估内膜增生程度。应用Tissue Gnostics显微镜记录图片。

2 结果

2.1AngⅡ诱导VSMC增殖迁移情况 应用组织贴片法原代培养大鼠胸主动脉来源的VSMC，用免疫荧光法检测培养细胞中α-SMA的表达(图1)，表明培养细胞可用于进一步实验。应用划痕实验检测VSMC迁移情况，24 h后AngⅡ组细胞划痕宽度明显减小，细胞向划痕处迁移，空白对照组细胞无此现象；AngⅡ组细胞迁移情况优于空白对照组(P<0.05)。见图2。应用MTT法检测VSMC增殖情况，结果显示AngⅡ组细胞增殖情况优于空白对照组(P<0.05)，见图3。

图1 免疫荧光法检测原代培养的血管平滑肌细胞中α-平滑肌肌动蛋白表达(×400)

图2 划痕实验观察AngⅡ对VSMC迁移的作用(×100)

图3 MTT法检测AngⅡ对VSMC增殖的影响

2.2Cap抑制AngⅡ诱导的VSMC表型转化情况 为观察Cap对AngⅡ诱导的VSMC增殖、迁移的影响，我们给予Cap(1 μmol/L)及CapZ(1 μmol/L)后观察细胞增殖迁移情况。应用MTT和Western blot法检测细胞PCNA表达，观察细胞增殖情况；应用划痕试验及Western blot法检测细胞MMP-9表达，观察细胞迁移情况。结果显示，AngⅡ组大于空白对照组，AngⅡ+Cap组小于AngⅡ组，AngⅡ+Cap+CapZ组大于AngⅡ+Cap组(P<0.05)；PCNA和MMP-9水平，AngⅡ组大于空白对照组，AngⅡ+Cap组小于AngⅡ组，AngⅡ+Cap+CapZ组大于AngⅡ+Cap组(P<0.05)。见图4～6。

图4 划痕实验检测各组大鼠VSMC迁移情况

2.3Cap对DOCA-盐饮食大鼠血压的影响 单纯Cap膳食干预对大鼠血压无明显影响，DOCA组SBP较Con组显著升高(P<0.05)，提示Cap膳食本身对SBP无明显影响。DOCA+Cap组SBP较DOCA组升高程度明显减小(P<0.05)；DOCA+Cap+CapZ组SBP较DOCA+Cap组又明显升高(P<0.05)。见表1、图7。

图7 Cap膳食对DOCA-盐饮食大鼠血压的影响

表1 Cap膳食对DOCA-盐饮食大鼠收缩压的影响

2.4Cap对DOCA-盐引起的高血压大鼠血管重构的影响 颈动脉内膜增生程度，DOCA组明显大于Con组，DOCA+Cap组明显小于DOCA组，DOCA+Cap+CapZ组明显大于DOCA+Cap组(P<0.05)，见图8。

图8 HE染色观察Cap膳食对高血压大鼠颈动脉内膜的影响(×200)

3 讨论

已经证实，高血压是脑卒中的独立危险因素[10]。在高血压慢性病程中，各级动脉出现结构或功能上的系列改变，最终引起血管重构。高血压动脉重构的早期事件和重要环节是VSMC的表型转化。成年个体血管中VSMC主要为分化表型，多种收缩蛋白高表达，而维持非常低的增殖与合成能力，主要发挥收缩功能以调节血管张力和维持血压。

图5 MTT法检测各组大鼠VSMC增殖情况

图6 Western blot法检测各组大鼠VSMC PCNA和MMP-9的表达

与骨骼肌或心肌细胞不同的是，VSMC可以在各种刺激下发生去分化而出现未分化细胞的表型特征，如增殖迁移活跃、基质蛋白合成增多、离子通道和微结构改变等，被称为表型转化。适度的VSMC表型转化是血管对环境刺激的适应性反应。例如在轻度机械损伤或血管生成时，VSMC发生表型转化，通过增殖、迁移并合成细胞外基质促进血管修复或血管形态的形成。但是在血压升高的情况下，VSMC的表型转化导致VSMC大量增殖和迁移，并在内膜下聚集，分泌大量细胞外基质和多种炎性因子，最终引起血管重构和血管疾病的发生[9]。发生了表型转化的VSMC是血管重构的主要成分，在动脉粥样硬化病变中，增殖的VSMC及其分泌的细胞外基质占病变体积的70%以上[11]。原代培养的大鼠胸主动脉VSMC在AngⅡ刺激下发生表型转化，细胞增殖迁移能力显著增强。我们应用DOCA-盐模型在体研究高血压对血管内膜增生的作用，结果显示，高血压状态下，DOCA组大鼠颈动脉内膜较Con组大鼠增生明显，动脉内膜显著增厚。

Cap是辣椒中的辛辣成分，在世界范围内作为蔬菜和香料食用[12]。研究发现，Cap膳食可以改善内皮细胞功能[13]，减轻动脉粥样硬化[14-15]，延缓脑卒中的发生。此外，Cap膳食还能够改善脑卒中后脑血管侧支循环[16-18]。还有研究证实，Cap可以维持血糖稳态，改善高血糖诱导的内皮功能障碍，并预防糖尿病心血管并发症[19-20]。本研究表明，Cap能够抑制AngⅡ诱导的原代培养的VSMC增殖迁移。在体研究结果显示，Cap膳食能够显著降低DOCA-盐饮食大鼠血压的升高，且能够明显减轻高血压引起的颈动脉内膜增生。

总之，Cap能够抑制VSMC表型转化，降低DOCA-盐引起的大鼠血压升高，减轻因高血压导致的大鼠颈动脉内膜增生，为高血压引起的血管重构治疗提供了新方法。