超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡肉、鸡蛋中尼卡巴嗪、金刚烷胺、金刚乙胺残留量

◎ 欧阳思雨，蓝 伟，贾 佳，胡秋连，杜裕芳

（江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院，江西 南昌 330000）

尼卡巴嗪（Nicarbazin）是一种广谱、稳定、高效的抗球虫药物，因此用作饲料添加剂预防鸡球虫病是非常广泛的，然而尼卡巴嗪残留物代谢缓慢[1]，易通过食物链对人体健康产生潜在威胁。金刚烷胺（Amantadine）和金刚乙胺（Rimantadine）作为一类抗流感病毒药物，也易被非法用于畜禽养殖业，若被非法滥用则易导致个体产生抗药性甚至导致病毒产生变异，同样会对人们产生危害。而鸡肉和鸡蛋是人类日常生活中主要食物来源之一，目前液质通常是按照食品安全国家标准分开检测尼卡巴嗪和金刚烷胺、金刚乙胺，作为常检项目，本文旨在建立一种同时检测鸡肉和鸡蛋中尼卡巴嗪、金刚烷胺和金刚乙胺的方法，既可以实现对鸡肉和鸡蛋类食品进行大批量、快速高效的定性和定量分析测定，也能满足市场需求，对药物残留问题起到日常监管作用。

1 材料与方法

1.1 试剂耗材

盐酸金刚烷胺，Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.4%；盐酸金刚乙胺，Standard Chemicals，99.2%；尼卡巴嗪，BePure，99.7%；金刚烷胺-D15，BePure，99.2%；美金刚-D6，CATO，98.0%；尼卡巴嗪-D8，WITEGA，99.9%；甲醇、乙腈、二甲基甲酰胺、正己烷、甲酸，均为色谱纯；冰乙酸、无水硫酸钠，分析纯；PSA净化吸附剂（乙二胺-N-丙基硅烷），粒度40 μm；滤膜，0.22 μm。市售鸡肉和鸡蛋。

1.2 仪器设备

沃特世TQS液质联用仪，美国沃特世公司；SL8台式离心机，美国Thermo Fisher Scientific公司；Vortex Wizard涡旋仪；N-EVAP氮吹仪，美国-Organomation公司；QUINTIX213-1CN电子天平，上海-赛多利斯公司。

1.3 标准品及标准溶液配制

分别精密称取标准物质和内标物质适量，置于6只10 mL容量瓶中，金刚烷胺、金刚乙胺、金刚烷胺-D15和美金刚-D6用甲醇定容，尼卡巴嗪和尼卡巴嗪-D8用二甲基甲酰胺定容。将上述标准储备液，用甲醇稀释得到金刚烷胺、金刚乙胺、尼卡巴嗪的混合标准使用液和金刚烷胺-D15、美金刚-D6、尼卡巴嗪-D8的混合内标使用液。

分别吸取上述混合标准使用液，用50%乙腈定容，得到混合外标浓度均为1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL-1，内标金刚烷胺-D15、金刚乙胺-D6、尼卡巴嗪-D8浓度为20 ng·mL-1、10 ng·mL-1、50 ng·mL-1的标准系列工作液。

1.4 样品处理

称取均质后的样品2 g于50 mL离心管中，加入混合内标使用液10 μL，加1%乙酸乙腈溶液10 mL，涡旋2 min，4 500 r·min-1离心5 min，上清液转移至另一离心管中，重复提取1次，合并两次上清液，加无水硫酸钠3 g，正己烷10 mL，涡旋1 min，4 500 r·min-1离心3 min，弃去正己烷层，剩余溶液转移至离心管中，40 ℃氮吹至近干，用1.0 mL甲醇溶解残渣，加入PSA 50 mg，涡旋30 s，离心，吸取上清液0.5 mL 40 ℃氮气吹干，加入50%乙腈水溶液0.5 mL，涡旋30 s，溶液过0.22 μm滤膜待测。

1.5 仪器分析条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱：Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流速：0.25 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：1 μL；优化后的流动相洗脱梯度见表1。

表1 梯度洗脱程序表

1.5.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：金刚烷胺和金刚乙胺为正离子扫描，尼卡巴嗪为负离子扫描；检测方式：多反应离子检测；毛细管电压：ESI+2.75 kV，ESI-2.46 kV；脱溶剂气温度：450 ℃；脱溶剂气流量：800 L·h-1；锥孔反吹气流量：150 L·h-1。优化后的相关参数见表2。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

金刚烷胺、金刚乙胺结构中均含有氨基且极性较强[2]，而尼卡巴嗪使用乙腈提取效率较好[3]，分别选用纯乙腈、1%乙酸乙腈、5%乙酸乙腈作为提取溶剂，考察不同提取溶剂对3种化合物的提取效果，结果表明1%乙酸乙腈对金刚烷胺和金刚乙胺的提取效果优于纯乙腈，对尼卡巴嗪的提取效果优于5%乙酸乙腈，因此选择1%乙酸乙腈作为提取溶剂，既能提高金刚烷胺和金刚乙胺的提取效果，又能保证尼卡巴嗪的提取效果。无水硫酸钠能使水饱和，将目标物充分萃取到乙腈层，而选择有机溶剂之后再加入盐，可以避免样品局部过热导致的回收率降低。PSA主要用于去除样品中的有机酸和糖类等物质，减少样品基质中的干扰[4]。

表2 质谱参数表

2.2 仪器条件优化

金刚烷胺和金刚乙胺分子结构中的氨基在离子化过程中易得到H+形成稳定的[M+H]+离子，因此采用电喷雾正离子（ESI+）扫描模式；尼卡巴嗪容易丢失H+以形成稳定的[M-H]-离子，因此采用电喷雾负离子（ESI-）扫描模式。在MS定量分析时，采用金刚烷胺-D15作为金刚烷胺的内标物质，美金刚-D6作为金刚乙胺的内标物质，尼卡巴嗪-D8作为尼卡巴嗪的内标物质，来进行定量分析，以用于控制样品提取净化、分离和电离等过程中的误差。流动相则选择使用基线更平稳、得到更好峰形的乙腈和可以增加金刚烷胺、金刚乙胺的电离效果以及对尼卡巴嗪影响不太大的0.1%甲酸水，来进行洗脱分离，3种组分都能达到较好的峰形和分离度，见图1。

图1 各组分离子对质谱图

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线及灵敏度

以目标物的浓度与相应的峰面积建立曲线，权重1/x，计算信噪比，以S/N≥10确定定量限。各物质信噪比见表3。

表3 各组分上机浓度及信噪比表

2.3.2 基质效应

基质效应计算公式为

式中：A为基质标准点的峰面积；B为溶剂标准点的峰面积；|ME|≤20%，可认为该基质没有基质效应[5]。

不加内标溶液参照1.4样品处理得到样品的基质溶液，用基质溶液配制标准点，上机测定，得到基质标准点的峰面积，与溶剂标准点峰面积比较，计算尼卡巴嗪、金刚烷胺、金刚乙胺的|ME|值分别为11.39%、4.19%、5.15%，均小于20%，可以判断，尼卡巴嗪、金刚烷胺和金刚乙胺在鸡肉和鸡蛋中基本无基质效应。

2.3.3 回收率和精密度

分别在阴性样品中添加0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1共3个浓度水平的3种物质混合标准使用液，每个水平做6平行，按照1.4样品处理方法进行处理测定，结果见表4，本方法回收率为80.4%～112.3%，相对标准偏差为3.4%～7.3%，能满足尼卡巴嗪、金刚烷胺和金刚乙胺的检测要求。

表4 三梯度六平行加标回收率表

2.3.4 实际样品检测

采用上述方法随机检测了市场上60批鸡肉样品和20批鸡蛋样品，其中一份鸡肉样品中检出尼卡巴嗪含量为61 μg·kg-1，其余样品均未检出上述3种成分残留。

3 结论

本实验建立了一种超高效液相色谱串联质谱同时测定鸡肉、鸡蛋中尼卡巴嗪、金刚烷胺、金刚乙胺残留量的检测方法。优化了色谱条件、质谱条件，采用内标校正，定量限低，灵敏度高，准确度好，回收率好，能够同时进行鸡肉、鸡蛋中尼卡巴嗪、金刚烷胺和金刚乙胺的定量测定，可节省部分成本，大批量快速筛查鸡肉和鸡蛋中的这3种成分，能够更加快捷地完成检验检测机构日常样品的检测需要，可用于实际测定。