姜黄和雪莲培养物协同增效胶原蛋白改善地塞米松诱导软骨损伤的作用研究

◎ 余宗盛，黎新江，陈小娟，杜玉兰，李晓敏，栗原博，毛新亮

（1.完美（广东）日用品有限公司，广东 中山 528400；2.广东完美生命健康科技研究院有限公司，广东 中山 528400）

骨关节健康养护的功能食品兴起于欧美市场，国内市场则在近几年兴起。骨关节健康重点关注的是预防和改善骨性关节炎。在中国，双膝骨关节炎患病率达15.6%，并以中老年患者居多，骨性关节炎严重影响了人们的生活质量。研究表明，骨性关节炎发病与年龄、性别、肥胖、运动损伤、自身免疫以及炎症代谢等因素密切相关，主要病理表现为软骨基质的持续降解[1]。软骨基质主要包括大分子多糖类物质、胶原蛋白、水分以及无机盐，其中胶原蛋白中以Ⅱ型胶原蛋为主，Ⅱ型胶原蛋白具有维持软骨组织结构完整性、刺激软骨细胞生长分化、提升关节性能和促进骨形成的作用[2-4]。除抗炎止痛外，补充含胶原蛋白的功能性食品是缓解软骨流失与促进软骨再生的重要预防和改善措施。研究表明，软骨胶原蛋白肽可与非变性II型胶原蛋白协同预防和治疗关节炎[5]。中药尤其是药食两用的药材是否对胶原蛋白具有增效作用则鲜有报道。因此，本研究采用地塞米松诱导的斑马鱼软骨损伤模型，探索姜黄与雪莲培养物对胶原蛋白保护软骨组织的协同增效作用，并采用胶原蛋白和药食两用的普通食品原料组合开发一款功能性食品，为预防骨关节炎和改善关节健康提供一种新途径，减少药物治疗的成本。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

解剖显微镜（SZX7，OLYMPUS，日本），显微镜相机（VertA1），精密电子天平（CP214，OHAUS，美国），荧光显微镜（AZ100，Nikon，日本）。

姜黄（BCW-050 1712/B-11，上海诚一食品），雪莲培养物（H181001，大连普瑞康生物），非变性II型胶原蛋白（20170902F，海南盛美诺生物），水解II型胶原蛋白（20181125D，海南盛美诺生物），硫酸软骨素A钠盐（6815，上海阿拉丁），乙酸地塞米松（LT80O93，北京百灵威科技），甲基纤维素（Sigma，美国）。

基于本研究制成的完美牌臻固力固体饮料（批次：20 190620；规格：1 g/袋），完美（广东）日用品有限公司生产。

1.2 斑马鱼与供试品处理

2日龄的Tg（col2a1a:EGFP）转基因软骨荧光斑马鱼以自然成对交配繁殖方式获得，饲养于28 ℃的养鱼用水中（水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为480～510 μS·cm-1；pH为6.9 ～7.2；硬度为53.7～71.6 mg·L-1CaCO3）。所有饲养管理过程均符合国际AAALAC认证要求。

随机选取270尾斑马鱼分为正常组、模型组、硫酸软骨素阳性组（1 000 μg·mL-1）、姜黄组（0.997 µg·mL-1）、雪莲培养物组（0.997 µg·mL-1）、胶原蛋白组（60.505 µg·mL-1）、胶原蛋白+姜黄组（61.503 µg·mL-1）、胶 原 蛋 白+雪 莲 培 养 物 组（61.503 µg·mL-1）和胶原蛋白+姜黄+雪莲培养物组（62.5 µg·mL-1），每孔30尾，置于六孔板中给药处理。将地塞米松（25 mmol·L-1）与供试品溶于水中处理斑马鱼，每孔为3 mL，正常组给予等体积的养鱼用水。于72 h后采用荧光显微镜检测斑马鱼的绿色荧光强度。

1.3 检测与分析

每个实验组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照并保存图片，用NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算荧光强度（S）。软骨再生作用计算为软骨再生率=(S供试品组-S模型组)/S模型组×100%

1.4 数据处理

用GraphPad 5.0软件对数据进行统计学分析，其中两组间比较采用t-test检验，多组间比较采用oneway ANOVE方差分析（方差齐时）或Dunnett’st-检验（方差不齐时），p＜0.05表明具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 模型建立与阳性药硫酸软骨素对软骨再生的影响

如图1与表1所示，与正常对照组相比，地塞米松组斑马鱼软骨的荧光强度显著降低（p＜0.001），表明模型建立成功。而阳性对照药硫酸软骨素（1 000 μg·mL-1）显著增强了地塞米松处理后软骨的荧光强度（p＜0.001），其软骨再生率为66%。由此可见，硫酸软骨素对斑马鱼软骨再生具有明显的促进作用。

2.2 姜黄、雪莲培养物、胶原蛋白对损伤软骨再生的影响

相较于模型组，姜黄（0.997 µg·mL-1）、雪莲培养物（0.997 µg·mL-1）、胶原蛋白（60.505 µg·mL-1）均能不同程度地增强软骨的荧光强度（图1与表1）。姜黄对软骨的促进作用较弱，无显著性差异（p＞0.05）。而雪莲培养物与胶原蛋白显著促进了软骨的修复（p＜0.001），软骨再生率分别为48%和73%（表1）。表明姜黄、雪莲培养物、胶原蛋白对损伤软骨再生均有促进作用，且胶原蛋白＞雪莲培养物＞姜黄。

2.3 姜黄、雪莲培养物和胶原蛋白复配对损伤软骨再生促进的影响

姜黄与雪莲培养物分别与胶原蛋白进行复配时（61.503 µg·mL-1），对胶原蛋白的软骨保护作用产生了一定的拮抗作用，使其软骨再生率从73%下降为63%和64%。而姜黄、雪莲培养物与胶原蛋白三者复配物（62.500 µg·mL-1）的软骨再生率却提升至82%（表1）。由此可见，单独使用姜黄或雪莲培养物复配胶原蛋白时，会使胶原蛋白促进损伤软骨再生效果下降，发生拮抗作用；而两者同时复配可产生协同增效作用，增强胶原蛋白的功效。

表1 各组斑马鱼的软骨EGFP荧光强度与软骨再生率表

3 功能性食品改善膝骨关节炎的有效率研究

基于本研究开发了一款功能性食品——完美牌臻固力固体饮料，现就其改善膝骨关节炎的有效率进行调查。以填写《膝骨性关节炎程度调查问卷》的方式征集人群，同时采用年龄≥50岁，晨僵时间≤30 min，活动时有骨摩擦音，X线片显示关节间隙变窄、软骨下骨硬化和（或）囊性变、关节边缘骨赘形成4项标准要求综合选定食用完美牌臻固力固体饮料的对象，共计32人。其中6人完全符合4项标准，19人满足其中1项标准，7人属于《膝骨性关节炎程度调查问卷》中关节症状评分排名前7位的人员。

食用完美牌臻固力固体饮料1个月后，有效样本25人。参照《中药新药临床研究指导原则》，根据试用前后症状积分下降百分率进行功能评价判断，功能效果分为显效（症状积分减少≥70%）、有效（30%≤症状积分减少＜70%）、无效（症状积分减少＜30%）3个等级，计算公式（尼莫地平法）为（试用前总积分-试用结束后总积分）/试用前总积分×100%，总有效率=（显效例数+有效例数）/总试用例数×100%。

调查结果显示，完美牌臻固力固体饮料试用1个月，按《中药新药临床研究指导原则》标准，改善膝骨性关节炎总有效率为52.0%。

4 结论

本研究以转基因软骨荧光斑马鱼为模型，揭示了姜黄、雪莲培养物、胶原蛋白组合物对损伤关节软骨再生的促进作用。此外，通过配方实验发现姜黄、雪莲培养物两种中药单独复配胶原蛋白时会降低其损伤软骨再生促进作用；姜黄、雪莲培养物两者同时和胶原蛋白进行复配将协同增效胶原蛋白的软骨再生功能。斑马鱼作为一种非哺乳类模式生物，具有胚胎透明、骨骼发育迅速、与人类基因高度同源等特点，在骨研究领域已逐渐成为重要的药物筛选模型[6]。在功能食品开发过程中，采用斑马鱼作为骨关节软骨损伤改善作用的筛选模型也已发挥了重要的作用，筛选了姜黄、雪莲培养物、非变性II型胶原蛋白、水解II型胶原蛋白重要的组合物并以优选的组合比例开发了预防和改善膝骨关节炎的功能性食品，为后续功能性食品开发提供了一条可借鉴的研发思路。