复合益生菌固体饮料调节小鼠肠道菌群的研究

◎ 严建刚，姚康飞，郭亚娟，李 艳，袁 方，毛新亮

（1.完美（广东）日用品有限公司，广东 中山 528400；2.广东完美生命健康科技研究院有限公司，广东 中山 528400）

肠道被喻为人体的“第二大脑”，也是人体最大的消化器官，肠道疾病与人体健康息息相关[1]。肠道疾病以炎症性肠病居多，它是一种非传染性疾病，会引起腹泻、腹痛、便血、呕吐和营养不良等症状，严重时诱发结肠癌。美国华盛顿大学健康指标和评估研究所联合消化疾病研究所的统计报告显示，从1990年到2017年，全球炎症性肠炎患病人数从370万人上升到680万人，增加了85.1%[2]。临床研究表明，肠道菌群失调是肠道疾病重要激发因素之一，主要表现在有益菌群数量减少和有害菌群数量增多[3-4]。

益生菌是一类通过定植在人体内，改变其菌群组成，并对其产生有益作用的活性微生物[5]。当摄入一定数量益生菌后，能促进肠道有益菌增殖，进而调节宿主肠道内菌群。肠道菌群在宿主中参与营养物质分解、调控代谢、维稳免疫系统等多方面生理活动[3]，从而影响炎症反应发生[6-7]。目前，市场上益生菌类食品主要添加乳杆菌和双歧杆菌。乳双歧杆菌HN019是一株从酸奶中分离得到的革兰氏阳性菌，具有促进肠道蠕动、抗炎症和调节免疫等功效[8]。鼠李糖乳杆菌HN001最初从干酪中分离出来，该菌株作为乳制品的一部分被应用20多年，具有抵抗结肠炎症、降低胆固醇以及调节肠道菌群的作用[9-10]。嗜酸乳杆菌NCFM是一种从健康人体粪便中分离出来的菌，具有良好耐酸、耐胆盐特性，在临床实验中口服能改善功能性肠病患者腹胀[11]。

随着健康意识的增强，人们疾病医学的理念逐渐从治疗转向预防，因此从日常膳食补充剂出发寻求有效调理肠道菌群功能的食品以预防炎症性肠病是健康产业发展的重点。本文将嗜酸乳杆菌NCFM、鼠李糖乳杆菌HN001和乳双歧杆菌HN019制备复合益生菌固体饮料，通过《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）对小鼠粪便菌群进行分析，以研究复合益生菌制剂对小鼠肠道菌群的调节作用，为预防炎症性肠病功能食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

复合益生菌固体饮料（完美亿生菌固体饮料TM，不少于1×1010CFU·g-1活菌，成分：鼠李糖乳杆菌HN001、嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌HN019、赤藓糖醇、低聚果糖和蓝莓粉），由完美（中国）有限公司提供。磷酸盐缓冲液（0.01 mol·L-1，pH=7.2）和吐温80由国药集团化学公司提供；伊红美蓝琼脂由广东环凯微生物公司提供；革兰氏染色液试剂盒、BBL琼脂、D-环丝氨酸和胰䏡-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂由青岛高科园海博生物公司提供；LBs琼脂、叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂和柠檬酸铁铵由北京陆桥技术公司提供。

酸盐缓冲液（0.01 mol·L-1，pH=7.2）配制：磷酸氢二钠2.58 g，磷酸二氢钠0.44 g，用纯净水溶解并定容至1 L，115 ℃高压杀菌20 min，冷却至室温备用。

培养基配制：按试剂盒说明书配制，115 ℃高压杀菌20 min，冷却至室温，现配现用。

1.1.2 实验动物

40只雄性Balb/c小鼠（SPF级），体重范围为20.5～22.4 g，由湖南斯莱克景达实验动物公司提供，许可证号：SCXK（湘）2016-0002；恒温恒湿饲养，温度为（23±2）℃，湿度为45%～60%。

1.1.3 仪器与设备

PL2002电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）公司；BSC-1100ⅡA2-X生物安全柜，济南鑫贝西生物公司；LDZM-80KCS蒸汽灭菌锅，上海申安仪器公司；PYL-230电热恒温培养箱，天津市莱伯特瑞仪器公司；SPL-250培养箱，天津市莱伯特瑞仪器公司；BX43型生物显微镜+MD50型数码成像系统，奥林巴斯（上海）公司；MS105DU电子分析天平，梅特勒-托利多中国有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与给药方法

选用检疫合格的雄性Balb/c小鼠40只，随机分为4组，即空白对照组、复合益生菌固体饮料低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只。复合益生菌固体饮料低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠每天分别灌胃0.33 g·(kg·bw)-1、0.67 g·(kg·bw)-1、1.00 g·(kg·bw)-1益生菌固体饮料。所有样品用水溶解，并按20 mL·kg-1灌胃，空白对照组每天灌胃相同剂量纯净水，每日一次，连续灌胃30 d，并每天定时对小鼠进行称重，并监测其摄食量。

1.2.2 小鼠肠道菌群检测

给样前、给样第14 d后的第24 h及给样第30 d后的第24 h，分别在无菌干燥环境下收集小鼠肛门新鲜粪便并称重，保存置无菌离心管，随后加入磷酸盐缓冲液（0.01 mol·L-1，pH 7.2）稀释振荡，使粪便终浓度为0.01 g·mL-1，设定为10-1。根据预实验结果，用磷酸盐缓冲液对母液进行10倍梯度稀释，选择3个合适的稀释度进行培养计数。双歧杆菌培养：母液稀释至10-4～10-6，接种在BBL琼脂培养基，置于37 ℃厌氧环境中培养48 h。乳杆菌培养：母液稀释至10-4～10-6，接种在LBs培养基，置于37 ℃厌氧环境中培养48 h；肠球菌：母液稀释至10-1～10-3，接种在叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂培养基，置于37 ℃有氧环境中培养48 h；肠杆菌：母液稀释至10-1～10-3，接种于伊红美蓝琼脂培养基，置于37 ℃有氧环境中培养48 h；产气荚膜梭菌：母液稀释至10-1～10-3，接种于TSC琼脂培养基，置于37 ℃厌氧环境中培养24 h。依据《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）调节肠道菌群功能检验方法，通过菌落形态比较、革兰氏染色镜检等相应方法鉴定，确定样品生长菌落为目标菌后，计数并乘以稀释倍数，以菌落数的对数值（lgCFU·g-1）表示，并按结果判定标准进行实验结果判定。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 复合益生菌固体饮料对小鼠生长的影响

由表1可知，在实验期间，所有小鼠精神状态、活动、摄食、排泌等均未见明显异常，体重缓慢增长。与空白对照组相比，各实验组小鼠平均体重在喂食复合益生菌固体饮料期间均未见异常。上述结果表明复合益生菌固体饮料对小鼠的生长无不良影响。

表1 复合益生菌固体饮料对小鼠体重的影响表（±s，n=10）

表1 复合益生菌固体饮料对小鼠体重的影响表（±s，n=10）

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2.2 复合益生菌固体饮料对小鼠肠道菌群的影响

2.2.1 复合益生菌固体饮料对小鼠粪便肠杆菌菌落数的影响

由表2可知，干预前各组小鼠间粪便中肠杆菌菌落数均未见统计学差异；干预14 d后，与干预前相比，高剂量组小鼠粪便肠杆菌菌落数显著减少（P＜0.05）。干预30 d后，与空白对照组相比，中剂量组小鼠粪便肠杆菌菌落数显著减少（P＜0.05）；与干预前相比，中剂量组小鼠粪便肠杆菌菌落数极显著减少（P＜0.01）。整体而言，复合益生菌固体饮料对小鼠肠杆菌菌落具有抑制作用。

表2 复合益生菌固体饮料对小鼠粪便肠杆菌菌落数的影响表（±s，n=10）

表2 复合益生菌固体饮料对小鼠粪便肠杆菌菌落数的影响表（±s，n=10）

注：与空白对照组相比，*P＜0.05；与同组干预前相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.2.2 复合益生菌固体饮料对小鼠粪便肠球菌菌落数的影响

由表3可知，干预前各组小鼠间粪便中肠球菌菌落数均未见统计学差异；与空白对照组相比，喂食30 d后，中剂量组小鼠粪便肠球菌菌落数显著减少（P＜0.05）。与干预前相比，干预14 d后低剂量组和高剂量组小鼠粪便肠球菌菌落数均极显著减少（P＜0.01），干预30 d后复合益生菌固体饮料所有组别小鼠粪便肠球菌菌落数均显著或极显著减少（P＜0.05或P＜0.01），该结果表明复合益生菌固体饮料对肠球菌的定植具有阻抗作用。

表3 复合益生菌固体饮料对小鼠粪便肠球菌菌落数的影响表（±s，n=10）

表3 复合益生菌固体饮料对小鼠粪便肠球菌菌落数的影响表（±s，n=10）

注：与空白对照组相比，*P＜0.05；与同组干预前相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.2.3 复合益生菌固体饮料对小鼠粪便产气荚膜梭菌菌落数的影响

由表4可知，干预前各组小鼠间粪便中产气荚膜梭菌菌落数均未见统计学差异；与空白对照组相比，各组小鼠粪便产气荚膜梭菌菌落数较干预前均未见统计学差异；与同组干预前相比，干预30 d后高剂量组小鼠粪便产气荚膜梭菌菌落数显著降低（P＜0.05），表明复合益生菌固体饮料具有减少产气荚膜梭菌作用。

表4 复合益生菌固体饮料对小鼠粪便产气荚膜梭菌菌落数的影响表（±s，n=10）

表4 复合益生菌固体饮料对小鼠粪便产气荚膜梭菌菌落数的影响表（±s，n=10）

注：与同组干预前相比，#P＜0.05。

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2.2.4 复合益生菌固体饮料对小鼠粪便乳杆菌菌落数的影响

由表5可知，干预前各组小鼠间粪便中乳杆菌菌落数无显著差异；干预14 d后，与同组干预前相比，中剂量组小鼠粪便乳杆菌菌落数显著增加（P＜0.05），表明复合益生菌固体饮料可增加乳杆菌的定植，对肠道微生物结构具有调节作用。

表5 复合益生菌固体饮料对小鼠粪便乳杆菌菌落数的影响表（±s，n=10）

表5 复合益生菌固体饮料对小鼠粪便乳杆菌菌落数的影响表（±s，n=10）

注：与同组干预前相比，#P＜0.05。

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2.2.5 复合益生菌固体饮料对小鼠粪便双歧杆菌菌落数的影响

由表6可知，干预前各组小鼠间粪便双歧杆菌菌落数均未见统计学差异；干预14 d后，与空白对照组相比，各给样组小鼠粪便双歧杆菌菌落数均未见统计学差异；干预30 d后，与同组干预前相比，低剂量组小鼠粪便双歧杆菌菌落数均显著增加（P＜0.05），表明复合益生菌固体饮料可增殖肠道双歧杆菌，增加肠道有益菌数量。

表6 复合益生菌固体饮料对小鼠粪便双歧杆菌菌落数的影响表（±s，n=10）

表6 复合益生菌固体饮料对小鼠粪便双歧杆菌菌落数的影响表（±s，n=10）

注：与同组干预前相比，#P＜0.05。

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3 结论与讨论

胃肠道中存在庞大而复杂的微生物，是人类健康和疾病的重要决定因素。健康生理状态下，肠道微生物处于平衡的共生生态系统中，可对食物中的营养素进行分解、消化以及促进吸收，保护肠道屏障防止病原体入侵，维持人体的正常功能。然而，这种平衡可能会被日常条件改变，如药物使用或干扰肠道生理学的病理，产生不利于生物体的环境。当肠道致病菌微生物占主导，会引发代谢功能紊乱，免疫力低下和器官病变。常见致病菌大多是肠杆菌和肠球菌，为革兰氏阴性菌，在体内产生毒素因子，破坏肠黏膜的完整性，引起炎症性肠炎[12]等疾病。本研究结果显示，小鼠食用复合益生菌固体饮料30 d后，中剂量组已可使粪便肠球菌和肠杆菌菌落数较食用前均明显降低，并且肠球菌菌落数下降趋势还呈现剂量递增效应，同时高剂量组小鼠粪便产气荚膜梭菌菌落数较食用前显著减少。对于肠道有益菌，低剂量组小鼠粪便双歧杆菌菌落数较食用前显著增加。按照《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）中调节肠道菌群功能检验方法的要求进行结果判定，复合益生菌固体饮料具有调节肠道菌群功能，可抑制致病菌生长，促进优势菌增殖。本文研究结果与郎春辉等[13]的报道基本一致，嗜酸乳杆菌NCFM和乳双歧杆菌HN019联用可抑制小鼠肠道致病菌数量，增强对外来有害微生物定植的阻抗力，对机体健康有保护作用。

益生菌抑制有害菌生长主要存在以下3个方面的作用机制[14-15]。①与病原菌竞争营养物质和黏附位点，抑制其在肠道组织的黏附和定植。②酵解肠道不易吸收食物，代谢短链脂肪酸，形成酸性微环境，抑制病原体生长。③释放抗菌肽，破坏病原菌细胞膜和细胞内结构。王韵婷等[16]研究结果也表明长双歧杆菌BB536联合乳双歧杆菌HN019益生菌制剂可提高乙酸、丙酸和丁酸3种短链脂肪酸含量，改善肠道微环境。此外，INTURRI等[17]使用琼脂孔扩散和肉汤微稀释方法对益生菌抗菌活性进行了体外研究，发现长双歧杆菌BB536和鼠李糖乳杆菌HN001对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和念珠菌具有抑制作用。综上所述，本研究复合益生菌固体饮料可对小鼠肠道正向调节，增加有益菌的增殖，同时抑制有害菌生长。本次研究进一步探究了益生菌在肠道中的作用，为调理肠道菌群功能食品的开发与研究提供帮助，但对其调节肠道菌群的机制尚未完全清楚，待进一步探究。