乙型病毒性肝炎患者血清微小RNA-101、脂肪酸结合蛋白4 mRNA、脂肪酸结合蛋白5 mRNA表达水平与肝纤维化程度的相关性

谭莉霞，董勇，华静，魏书堂

(河南大学第一附属医院 消化内科，河南 开封 475000)

乙型病毒性肝炎是常见的传染性疾病，其发病率较高[1]。肝纤维化是众多慢性肝病共有的可逆性病理过程，是慢性活动性肝病发展为肝硬化的必经阶段[2]。因此，早期评估和诊断肝纤维化对预防肝硬化的发生有十分重要的意义。目前肝穿刺病理学检查是诊断和评估肝纤维化的金标准，但肝穿刺作为一种有创性检查方式，无法动态和重复进行，临床中将其作为常规检查较为困难[3]。微小RNA-101(microRNA-101，miR-101)是一种与纤维化疾病有关的miRNA。王旭天等[4]研究发现miR-101a水平与乙型肝炎病毒相关性肝纤维化的严重程度密切相关。脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein，FABP)是一类同源性较高的细胞内蛋白，对脂肪酸的亲和力较高，主要参与细胞内脂肪酸的运输[5]。FABP4是一种脂肪型FABP，同时也是FABP家族中最具特征性的成员，可参与细胞生长、分化及肿瘤上皮-间质转化的过程[6]。FABP5是一种表皮型FABP，在肿瘤血管生成的调控机制中发挥重要作用[7]。本研究前期通过生物信息学预测网站TargetScanHuman(http://www.targetscan.org/vert_72/)预测发现，miR-101与FABP4、FABP5均存在靶向结合位点，推测FABP4、FABP5也可能参与肝纤维化的进展过程。因此，本研究通过探讨96例乙型病毒性肝炎患者血清miR-101、FABP4mRNA、FABP5mRNA水平与肝纤维化程度的相关性，以期为肝纤维化的评估和诊断提供新指标。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2020年3月至2021年3月于河南大学第一附属医院确诊的96例乙型病毒性肝炎患者，纳入乙型肝炎组。选取同期河南大学第一附属医院健康体检者94例作为对照组。对照组年龄36～60(46.83±9.25)岁，乙型肝炎组年龄36～59(46.94±8.76)岁。根据乙型病毒性肝炎患者肝纤维化程度将其分为S0期(40例)、S1期(28例)、S2期(16例)、S3期(12例)。(1)纳入标准：①乙型病毒性肝炎患者经穿刺活检、乙肝五项等综合检查确诊，符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[8]中的诊断标准且符合肝纤维化分期S0～S3期；②首次发病，确诊前未进行抗结核杆菌及抗乙型肝炎病毒治疗；③临床及影像学检查资料完整。(2)排除标准：①合并支气管炎、肺气肿、支气管扩张以及肺癌等；②伴有药物性肝病、自身免疫性肝病等影响肝功能指标的疾病；③孕妇及哺乳期女性或有严重精神障碍；④合并人类免疫缺陷病毒或其他病毒感染。本研究经医院医学伦理委员会审批。所有受试者签署知情同意书。收集整理所有受试者性别、体质量指数(body mass index，BMI)、年龄、饮酒史、吸烟史、高血压、高脂血症等一般资料。

1.2 主要试剂与仪器RNA提取试剂盒(货号：NEP017)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；反转录试剂盒(货号：GOY-C6397)购自上海谷研实业有限公司；qPCR SYBR®Green Mix(货号：GV357571)购自上海一基实业有限公司；Rox reference dye(货号：BYLP-31110)购自南京北鱼生物科技有限公司；qRT-PCR仪(型号：ABI 7700)购自美国ABI公司。

1.3 检测方法

1.3.1样品采集 采集健康体检者体检当天及乙型病毒性肝炎患者确诊后清晨空腹外周静脉血样5 mL，以3 000 r·min-1离心15 min(离心半径15 cm)后收集血清待测。

1.3.2血清miR-101、FABP4mRNA、FABP5mRNA水平检测 采用RNA提取试剂盒提取各受试者血清总RNA后采用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)仪扩增目的基因miR-101、FABP4、FABP5及其内参。qRT-PCR反应体系：qPCR SYBR®Green Mix(2×)5 μL，Rox reference dye(50×)0.2 μL，ddH2O 3.0 μL，上下游引物(10 μm)各0.4 μL，cDNA模板(50 mg·L-1)1 μL，引物序列见表1。各样品均重复3次，采用2-△△CT法定量分析血清中miR-101、FABP4mRNA、FABP5mRNA水平。

表1 qRT-PCR引物序列

2 结果

2.1 一般资料乙型肝炎组性别、年龄、BMI、饮酒史、吸烟史、高血压、高脂血症与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 乙型肝炎组和对照组一般资料比较

2.2 血清miR-101、FABP4mRNA、FABP5mRNA水平乙型肝炎组血清FABP4mRNA、FABP5mRNA水平高于对照组，miR-101水平低于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 乙型肝炎组和对照组血清miR-101、FABP4 mRNA、FABP5 mRNA水平比较

2.3 不同肝纤维化分期患者血清miR-101、FABP4mRNA、FABP5mRNA水平与S0期比较，S3期、S2期、S1期血清FABP4mRNA、FABP5mRNA水平较高，miR-101水平较低(P<0.05)；与S1期比较，S3期、S2期血清FABP4mRNA、FABP5mRNA水平较高，miR-101水平较低(P<0.05)；S3期血清FABP4mRNA、FABP5mRNA水平高于S2期，miR-101水平低于S2期(P<0.05)。见表4。

表4 不同肝纤维化分期患者血清miR-101、FABP4 mRNA、FABP5 mRNA水平比较

2.4 乙型病毒性肝炎患者血清miR-101与FABP4mRNA、FABP5mRNA水平的相关性Pearson法分析结果显示，乙型病毒性肝炎患者血清miR-101与FABP4mRNA、FABP5mRNA水平均呈负相关(r=-0.524、-0.590，P<0.05)，见图1和图2。

2.5 血清miR-101、FABP4mRNA、FABP5mRNA水平与乙型病毒性肝炎患者肝纤维化程度的相关性Spearman法分析结果显示，乙型病毒性肝炎患者肝纤维化程度与血清FABP4mRNA、FABP5mRNA均呈正相关(r=0.654、0.723，P<0.05)，与miR-101呈负相关(r=-0.861，P<0.05)，见图3。

miR-101为微小RNA-101；FABP为脂肪酸结合蛋白。

miR-101为微小RNA-101；FABP为脂肪酸结合蛋白。

miR-101为微小RNA-101；FABP为脂肪酸结合蛋白。

3 讨论

乙型病毒性肝炎病情发展缓慢，肝炎症反应明显，病毒无法被轻易清除，随着病情不断发展，可能会出现肝纤维化甚至肝硬化[9]。肝纤维化是肝对慢性损伤的一种愈合反应，各种因素所致的细胞外基质沉积与降解的动态平衡被打破，从而造成肝基质成分发生改变，最终导致肝纤维化[10]。探讨肝纤维化相关诊断和评估指标对进一步深入研究肝纤维化的发生发展机制及过程、指导研发新的治疗手段有重要意义。

FABP4是联系代谢性和炎症性疾病的重要因子，不仅能调节体内脂质代谢，还参与炎症过程及血管新生[11-12]。FABP5广泛分布于脂肪组织、血管内皮细胞、肝、肾等多种组织及器官中，且在宫颈癌、肝癌等多种肿瘤组织中呈高表达，并具有刺激肿瘤血管生成和促进肿瘤发生发展的作用[13-14]。本研究结果显示，乙型病毒性肝炎患者血清FABP4mRNA、FABP5mRNA水平高于健康人群，且血清FABP4mRNA、FABP5mRNA水平随着肝纤维化分期的增加而上升。这表明血清FABP4mRNA、FABP5mRNA水平的升高可能对肝纤维化的发生发展有重要提示作用。基于既往研究中FABP4、FABP5的作用机制，推测在乙型病毒性肝炎患者体内持续的慢性炎症刺激下，FABP4、FABP5以及白细胞介素等因子大量分泌并参与炎症反应，造成肝星形细胞活化，导致细胞外基质的沉积和重塑平衡倾向于细胞外基质沉积，促进肝纤维化进展。本研究中乙型病毒性肝炎患者血清miR-101与FABP4mRNA、FABP5mRNA水平呈正相关，与前期生物学信息网站预测结果一致。这进一步提示miR-101与FABP4mRNA、FABP5mRNA间存在靶向关系，FABP4mRNA、FABP5mRNA受miR-101靶向调控进而参与肝纤维化进展。miR-101与FABP4mRNA、FABP5mRNA表达水平均能反映肝纤维化程度，为评估肝纤维化提供可靠依据。但目前关于FABP4mRNA、FABP5mRNA与肝纤维化程度相关性的研究较少，且本研究中FABP4mRNA、FABP5mRNA表达水平可能受其他因素的影响，今后仍需更多的研究数据支持。

综上所述，血清miR-101、FABP4mRNA、FABP5mRNA水平与乙型病毒性肝炎患者肝纤维化程度密切相关，对肝纤维化的早期评估有一定的参考价值。临床可通过监测血清miR-101、FABP4mRNA、FABP5mRNA全面评估患者肝纤维化程度，积极调整用药及临床治疗方式，改善患者肝功能，提高疾病治疗效果。这进一步提示血清学指标对于评估肝功能和肝纤维化程度有潜在应用价值，值得进一步探讨和推广。但本研究年限较短且样本量有限，其结果尚需延长研究年限、扩大样本量进一步证实。