川续断提取物对氟苯尼考在鸡体内的药物动力学影响

王 斌，李思聪，李金良，梁 歌，张 敏，袁定胜，杨 锐，李旭廷

(四川省畜牧科学研究院/动物遗传育种四川省重点实验室，四川成都 610066)

氟苯尼考(florfenicol，FFC)是甲砜霉素的单氟衍生物，其作用机制及抗菌谱与甲砜霉素、氯霉素相同，能通过抑制细菌70S核糖体，与50S亚基结合，抑制肽酰基转移酶活性，从而抑制肽链的延伸，干扰细菌蛋白质的合成，因而对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑制作用。目前，氟苯尼考被广泛应用于兽医临床防治革兰氏阳性、革兰氏阴性以及甲砜霉素耐药性细菌病，因其抗菌谱广、吸收良好、体内分布广泛，在畜禽和水产动物的细菌性疾病防治中应用广泛[1]。川续断(DipsacusasperWall)是川续断科、川续断属多年生草本植物，川续断提取物主要含有生物碱、挥发油、三萜皂苷类、环烯醚萜类等成分，其中三萜皂苷类成分为川续断的主要活性成分，川续断中共有川续断皂苷Ⅵ、川续断皂苷Ⅹ、川续断皂苷B等20种三萜皂苷类成分，具有促进骨骼生长、预防肝损伤、治疗心脑血管疾病等丰富的药理作用[2]，在畜禽养殖上，川续断可用于促进动物生长，提高机体的非特异性免疫功能[3]。

中草药和西药相互作用的研究报道很多[4]，项目组近年也开展了冰片、双黄连口服液、黄连素、黄芩苷等对氟苯尼考代谢的影响研究[5-7]。目前国内外关于川续断提取物对西药的影响研究较少，本文开展川续断提取物在肉鸡体内对氟苯尼考代谢的影响研究，探讨可能发生的药物动力学相互作用及其机制，补充对川产道地药材川续断的药理学数据，为挖掘川续断的药用价值，也为推动中西结合药物动力学发展提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 30只大恒699公鸡，体重2.0 kg±0.1 kg，购自四川大恒家禽育种有限公司；饲料为不含任何抗生素和抗菌药的全价日粮，由动物遗传育种四川省重点实验室配置。

1.1.2 主要仪器 UltiMate3000高效液相色谱仪，美国戴安公司产品；ZGDCY-48S水浴氮吹仪，上海梓桂仪器有限公司产品；CQ250超声洗涤器，上海超声仪器厂产品；800B台式离心机，上海安亭科学仪器厂产品；WH-3微型旋涡混合仪，上海泸西分析仪器厂产品；MiniSpin Plus个人型高速离心机，德国艾本德公司产品；Step One型荧光定量PCR仪，美国应用生物系统公司产品。

1.1.3 药品与试剂 川续断提取物(每克相当于原生药3.3 g，含川续断皂苷Ⅵ≥6.6%)，动物遗传育种四川省重点实验室自制；氟苯尼考对照品(编号K0301703，含量为99.1%)，中国兽医药品监察所产品；氯霉素标准品(批号130555-201704)，中国药品生物制品检定所产品；氟苯尼考原料药(批号202012125，纯度为98.9%)，浙江康牧药业有限公司产品；甲醇、乙腈(色谱纯)，艾万拓化工产品贸易(上海)有限公司产品；乙酸乙酯等其余试剂均为分析纯，成都科龙化工试剂厂产品。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药方法 30只健康鸡随机分为2组，每组15只。试验组连续7 d每天灌服川续断提取物(0.3 g/kg，1次/d)，空白组则给予相应体积的生理盐水，禁食12 h后于第8天，氟苯尼考按剂量30 mg/kg(氟苯尼考原粉溶于100 g/L PEG-400配制成10 mg/mL溶液)分别灌服2个组的各10只鸡，并于给药后0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h翅下静脉采集血液约0.5 mL，EDTA抗凝，4 000 r/min离心5 min，分离血浆，置-20℃冰箱中保存待用。两个组剩余各5只鸡于第8天放血处死，分离肝脏和空肠组织于-80 ℃保存。

1.2.2 样品的处理 精确取血浆0.2 mL于试管中，加入10 μL氯霉素内标液(500 μg/mL)和800 μL乙酸乙酯，涡动混合2 min，4 000 r/min离心10 min，吸取上层液于另一离心管中，然后再加入乙酸乙酯800 μL重复提取1次，合并2次提取液。在40 ℃水浴中氮气吹干，残渣加入400 μL流动相溶解，涡动混合2 min，12 000 r/min离心10 min，将上清液转移至进样瓶，取20 μL进样检测。

1.2.3 标准曲线的制备 取空白血浆180 μL，加入20 μL氟苯尼考系列标准溶液，配制成50、20、10、5.0、2.5、0.5、0.1、0.05 μg/mL系列标准血浆样品，按“1.2.2”项下方法处理样品，以氟苯尼考与氯霉素峰面积的比值对相应氟苯尼考浓度作线性回归，求回归方程和相关系数。

1.2.4 色谱条件 色谱柱：Agilen HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(27∶73，V/V)；流速1.0 mL/min；检测波长223 nm；柱温40 ℃；进样量20 μL。

1.2.5 分析方法质量控制 以血浆样品高、中、低(0.1 μg/mL、2.5 μg/mL、20 μg/mL)3个浓度氟苯尼考考察方法的提取回收率和精密度，每个样品做5个重复，测得方法回收率分别为83.2%±1.6%、84.1%±2.3%和83.5%±2.2%，测得日内RSD分别为4.6%、2.3%和6.1%，测定日间RSD分别为4.5%、2.1%和6.2%。按信噪比S/N=3计算，最低检测限为0.02 μg/mL。

1.2.6 RT-PCR检测鸡肝脏和空肠CYP3A37、MDR1和CXR mRNA表达量 取100 mg组织用组织破碎仪进行破碎，按照说明书用Trizol法提取组织总RNA。测定样品OD 260 nm/OD 280 nm比值，确定RNA浓度和纯度，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。用反转录试剂盒将RNA反转成cDNA，利用Premier5.0软件设计鸡CYP3A37、MDR1、CXR和看家基因β-actin引物序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。实时荧光定量PCR检测上述基因mRNA转录水平，PCR反应体系20 μL：cDNA 模板2 μL；上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL；SybrGreen qPCR Master Mix10 μL；ddH2O 7.2 μL。反应程序如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 10 s，55 ℃～61 ℃ 15 s；72 ℃ 20 s，共45个循环；60 ℃延伸1 min。结果采用相对定量分析，用ΔCt法计算基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 结果

2.1 标准曲线

以氟苯尼考与氯霉素峰面积的比值对相应氟苯尼考浓度作线性回归，求回归方程和相关系数。得出氟苯尼考在浓度为0.05 μg/mL～50 μg/mL的范围内线性关系良好，回归方程为y=0.056 5x+0.021 8，相关系数R2=0.999 7。标准曲线见图1。

图1 血浆药物浓度标准曲线

2.2 药物动力学参数

试验组和对照组鸡均按单剂量(30 mg/kg)给予氟苯尼考后，测定不同时间点的氟苯尼考血药浓度，其血药浓度-时间曲线见图2所示，药物动力学参数见表2。结果表明，试验组AUC(0-∞)为57.907 mg/L·h±8.12 mg/L·h，与对照组47.729 mg/L·h±11.601 mg/L·h相比显著增加(P<0.05)，半衰期T1/2为3.649 h±0.193 h，与对照组2.520 h±0.255 h相比显著增加(P<0.05)，达峰时间Tmax为0.688 h±0.139 h，与对照组1.250 h±0.141 h相比显著降低(P<0.05)，清除率CL为0.426 L/h·kg±0.071 L/h·kg，与对照组0.657 L/h·kg±0.148 L/h·kg相比显著降低(P<0.05)，表观分布容积(Vd)、达峰浓度(Cmax)、平均驻留时间MRT(0-∞)，试验组和对照组之间差异不显著。

表2 试验组和对照组在鸡体内的氟苯尼考(30 mg/kg)药物动力学参数

图2 氟苯尼考在试验组和对照组鸡体内的(30 mg/kg)的血药浓度-时间曲线

2.3 川续断提取物对鸡肝脏和空肠中CYP3A37、MDR1和CXR mRNA表达的影响

结果如图3和图4所示，鸡按0.3 g/kg连续口服7 d川续断提取物后，肝脏和空肠中CYP3A37、和CXR mRNA显著低于对照组(P<0.05)，MDR1 mRNA表达水平也低于对照组，但差异不显著(P>0.05)。

图3 鸡口服川续断提取物对肝脏中CYP3A37、MDR1和CXR表达的影响

图4 鸡口服川续断提取物对空肠中CYP3A37、MDR1和CXR基因表达的影响

3 讨论

药物的相互作用(drug-drug interaction,DDI)指在一定时间内先后服用2种或2种以上药物后所产生的复合效应，可使药效加强或副作用减轻，也可使药效减弱或出现不应有的毒副作用。其中，代谢性药物相互作用是药物动力学相互作用的核心，是药物相互作用的重要环节。医学研究领域的多个研究报告表明，各种中草药会和许多处方药发生相互作用[8]，如服用抗过敏药物特非那定的患者同时饮用了抑制CYP3A4的葡萄柚汁导致特非那定中毒死亡[9]。贯叶连翘提取物能提高CYP3A4的表达量，而促进环孢霉素的代谢，血药浓度降低,导致吸收减少。兽医研究领域也开展了中兽药与西药间的相互作用研究，如杨靖、任伟龙[10-11]等研究发现，一定剂量的槲皮素影响恩诺沙星在肉鸡体内的药物动力学过程，造成达峰时间提前，达峰浓度及AUC降低；黄连素能显著促进恩诺沙星在肉鸡体内的吸收，减慢其排泄过程。本项目组前期研究发现，黄芩素可增加氟苯尼考在大鼠体内的吸收，减缓代谢消除，提高口服生物利用度，黄芩苷对非索非那定的吸收有明显促进作用[6,12]。但目前人们对中药成分与CYP450作用的研究多集中在单个有效成分上,对成分复杂的单味药提取物的研究很少，而在我国养殖业中，中草药的利用大多是作为饲料原料或提取物在使用，因此开展中兽药提取物对兽用专用化学药品的联合应用研究是有必要和有意义的。

本次试验对肉鸡每天灌胃给药川续断提取物(0.3 g/kg，1次/d)连续7 d，予以氟苯尼考灌服给药后，药物动力学参数结果发生明显变化，Tmax减少，提示氟苯尼考的吸收速度增加，T1/2的增加和CL的减少，提示氟苯尼考在体内的代谢减缓，总的来说，川续断提取物增加了氟苯尼考的在肉鸡体内的吸收速度并减缓了代谢，最终造成AUC增加，提高了氟苯尼考在鸡体内的生物利用度。

CYP450是人及畜禽体内重要的药物代谢酶，参与大部分的药物代谢，其中CYP3A4是人和动物肝脏中含量最丰富的CYP450酶，在鸡体内以CYP3A37为主，参与临床约50%的药物代谢[13]，P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)在药物吸收、分布、代谢及排泄方面有重要的作用[14]。鸡异生物体受体(Chicken xenobiotic receptor,CXR)是一种存在于禽类、与核受体超家族成员具有相似典型结构与功能的核受体，是CYP450酶和MDR1基因表达的调控的关键因子[15-16]，氟苯尼考在鸡体内的吸收代谢主要经由MDR1和CYP3A37完成[17]，因此本试验选择这2个基因的mRNA表达量进行考察，发现川续断提取物连续灌服7 d，对肉鸡肝脏和空肠的CYP3A37 mRNA和MDR1 mRNA表达有明显的抑制作用，对CXR mRNA表达也表现出显著的下调作用，提示可能是川续断提取物下调了CXR mRNA 表达，导致CYP3A37和P-gp mRNA的表达受到抑制，进而可能降低相对应的药物代谢酶/转运体酶活性，最终引起氟苯尼考在肠道吸收加快，代谢延缓，生物利用度增加，从而引起氟苯尼考药物动力学特征改变。此外，药物之间相互作用的关键因素除了主要涉及上述提及的CYP450 酶和药物转运体外，还涉及尿苷二磷酸、谷胱甘肽转移酶等其他的药物代谢酶[18]，同时和中草药的剂量、给药方案、给药途径和治疗范围、服药时间长短等也有影响，这都需要开展进一步的研究。

综上所述，川续断提取物对氟苯尼考在鸡体内的代谢有一定的影响，加快了氟苯尼考在体内的吸收速度和减缓了代谢，增加了氟苯尼考的生物利用度，提示临床上两者合用有潜在增效作用，可能原因是川续断提取物抑制了肝脏和空肠的CYP3A37 mRNA和P-gp的mRNA表达，但兽医临床具体的药效学结果有待进一步加以确证，以促进对川续断全面的认识，以及为临床合理用药提供依据。