胸膜肺炎放线杆菌在不同培养基中生长、生物膜形成及Apx毒素分泌能力的差异研究

吕佩帅，张丽红*，丁小松，郭芳芳，崔一芳，曹晓亚，徐福洲*

(1.山西师范大学生命科学学院，山西临汾 041000；2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室，北京 100097)

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)是一种革兰氏阴性短杆菌，感染猪引起以出血性、纤维素性和坏死性肺炎为特征的传染性胸膜肺炎，不同年龄猪均易感，特别是断奶仔猪感染后出现较高的发病率和病死率，而且APP感染后可在鼻腔、呼吸道上皮细胞和扁桃体中定植引起持续感染，给养猪业造成较大的经济损失[1]。抗菌药物防治和疫苗免疫是目前防控猪传染性胸膜肺炎的最有效手段，但使用抗菌药物造成APP耐药性问题日益严重[2]，而且通常应用的灭活疫苗对APP同种血清型保护效果较好而对不同血清型的交叉保护较差[3-4]，这些问题均给APP的防控带来挑战。

据报道，APP目前已鉴定19个血清型[5-6]，不同血清型之间毒力存在显著的差异[7]，因而鉴定APP不同血清型菌株的生物学特性对防控该病原具有重要意义。APP感染猪定植和致病过程中，涉及多种毒力相关因子[8]，其中主要包括生物膜形成和Apx毒素分泌。APP在适应环境和定植宿主过程中具有形成生物膜的能力，形成生物膜是APP产生耐药性、逃避宿主免疫和造成持续感染的重要机制，有利于细菌在猪体内定植与感染[9]。此外，Apx毒素也是APP最重要的毒力因子之一[1,7-8]，Apx毒素为RTX(repeats in the structural toxin)毒素家族的重要成员，根据溶血性和细胞毒性差异分为4种类型，即ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ，其中ApxⅠ溶血性和细胞毒性最强，因而分泌ApxⅠ毒素的血清1、5、9、10、11型也是APP中毒力最强的血清型[7]。研究显示，适当浓度的Ca2+可促进APP表达和分泌Apx毒素[10]；而且APP生长繁殖的不同时相Apx毒素的表达也有显著差异[11-12]。

本试验选用APP血清1型～12型参考菌株及2个分离株，首先鉴定APP菌株在不同种培养基中的生长能力，进而鉴定其在不同培养基中形成生物膜的能力及其对不同抗菌药物的耐药性，最后鉴定APP菌株在不同培养基中添加Ca2+对Apx毒素分泌的影响。研究结果将为分析APP不同血清型菌株在不同培养基中的生物学特性，以及疫苗研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细菌菌株 APP血清1型～12型参考菌株，由澳大利亚昆士兰大学Pat Blackall博士惠赠；分离株JS(血清1型)和JL(血清7型)，由北京市农林科学院畜牧兽医研究所分离鉴定。

1.1.2 主要试剂和设备 细菌培养用肉汤Brain-Heart Infusion (BHI)、Luria-Bertani (LB)、Mueller-Hinton Broth(MHB)、Pleuropneumonia-Like Organism (PPLO)和Tryptic Soy Broth(TSB)，BD Difco公司产品；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，Sigma公司产品；药敏纸片，Thermo Fisher Oxoid公司产品；蛋白超滤浓缩管Amicon Ultra-15 10 ku，Millipore公司产品；BioScreener C全自动生长曲线分析仪,Oy Growth Curves Ab Ltd.公司产品；多功能酶标测定仪Synergy H1,Bio-Tek公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌菌株复苏和培养 分别将APP保存菌种分区划线接种于TSB固体培养板上，37 ℃培养过夜，然后分别挑取单菌落接种于TSB中37 ℃振摇培养，所有培养基中均添加5 mg/L NAD，APP培养液保种备用。

1.2.2 生长曲线测定 选择APP血清1型、7型和10型参考菌株，分别培养后测定菌株在BHI、LB、MHB、PPLO和TSB培养基中的生长曲线。将不同血清型菌株分别在TSB培养液中培养，离心收集菌体沉淀，经0.01 mol/L PBS洗涤2次后，调整菌悬液OD 600 nm值至1.0，然后分别利用BHI、LB、MHB、PPLO和TSB培养基进行100倍稀释，稀释的菌液加入测定生长曲线的培养板中，每孔200 μL菌液，每个样品至少设置5个重复，空白培养基作为阴性对照，将培养板放入BioScreen C全自动生长曲线分析仪中，每隔2 h测定OD 600 nm值，测定16 h。同样的试验重复3次，取相同样品的OD 600 nm平均值绘制生长曲线。

1.2.3 生物膜形成测定 采用结晶紫染色法测定APP血清1型～12型参考菌株及分离株JS和JL在BHI、LB、MHB、PPLO和TSB培养基中形成生物膜的能力。简述为：前述处理与生长曲线测定方法相同，即将测定的APP所有菌株培养、洗涤、调整OD 600 nm值后分别用BHI、LB、MHB、PPLO和TSB培养基1∶100稀释，加入96孔聚苯乙烯微孔培养板中，每孔200 μL菌液，每个样品3个重复，37 ℃培养24 h。弃去培养液，每孔加入200 μL PBS洗涤3次，然后每孔加入100 μL甲醇固定15 min，弃去甲醇后自然干燥，每孔加入100 μL 10 mg/mL结晶紫溶液，室温染色10 min，弃去染液后用PBS洗涤3次，室温完全干燥，每孔加入100 μL 330 mL/L冰乙酸溶液，37 ℃作用30 min，利用多功能酶标测定仪Synergy H1测定OD 590 nm值。同样试验重复3次，取相同样品的OD590平均值(D值)，以未接种菌的培养液作为阴性对照，阴性值的2倍作为界限值(Dc)。判定标准为：强生物膜形成(D>2×Dc)；弱生物膜形成(Dc

1.2.4 药敏试验 利用头孢菌素类(头孢吡肟-4、头孢唑林、头孢噻肟-3)、青霉素类(氨苄西林)、碳青霉烯类(亚胺培南)、四环素类(四环素、多西环素)、林可霉素类(克林霉素)、喹诺酮类(环丙沙星、诺氟沙星、萘啶酸)、氨基糖苷类(庆大霉素、卡那霉素、链霉素)、大环内酯类(红霉素、阿奇霉素)、氯霉素类(氟苯尼考)、磺胺类(甲氧苄啶)、其他(硫酸黏菌素、万古霉素)等11类20种抗菌药物，测定APP不同血清型菌株对这些抗菌药物的敏感性，将大肠埃希氏菌参考菌株ATCC 25922作为药敏试验对照菌株，利用Oxoid公司药敏纸片进行测定，即将APP 12个参考菌株和2个分离株分别培养后调整OD 600 nm值至1.0，将菌液稀释1 000倍，取100 μL稀释菌液均匀涂布TSA平板，粘贴药敏纸片，37 ℃培养16 h，测量抑菌圈直径后根据产品说明书上的标准判定细菌对不同抗菌药物的耐药性。

1.2.5 Apx毒素分泌能力测定 将APP血清1型参考菌株在添加NAD的TSB中培养过夜，离心收集菌沉淀，经0.01 mol/L PBS洗涤2次后，调整菌悬液OD 600 nm值至1.0，然后分别按照1∶100稀释度转接入添加5 mmol/L CaCl2和不添加CaCl2的BHI、LB、MHB、PPLO和TSB培养液中，培养液体积均为20 mL，于37 ℃振摇培养，同时将稀释的菌液加入测定生长曲线的培养板中，利用Bio Screen C全自动生长曲线分析仪测定生长曲线。取培养6 h菌液经10 000 r/min离心20 min，收集上清液加入Amicon Ultra-15 10 ku中离心超滤浓缩，浓缩后体积约为0.5 mL，将蛋白浓缩液加入透析袋中，置于0.01 mol/L PBS中进行透析，透析24 h后吸出透析袋内的浓缩液进行SDS-PAGE电泳检测和Western blot，一抗为ApxⅠ蛋白免疫兔血清，稀释倍数为1∶200，二抗为HRP标记羊抗兔抗体，稀释倍数为1∶5 000，显色底物为增强型TMB。

2 结果

2.1 不同培养基中生长曲线测定结果

为测定APP菌株在不同培养基中的生长能力，选择了APP血清1型、7型和10型3株参考菌株，测定在BHI、LB、MHB、PPLO和TSB培养基中的生长情况，测定结果如图1所示。结果显示，APP不同菌株在BHI中生长最好，其次为TSB，而在MHB、LB和PPLO中生长较差；菌株在接种培养后2 h～6 h为对数生长期，6 h～8 h后达到平台期。

A.血清1型;B.血清7型;C.血清10型

2.2 生物膜形成能力测定结果

测定了APP血清1型～12型参考菌株及2个分离株在5种培养基中生物膜形成的能力，测定结果如图2所示。结果显示，从不同培养基比较结果看，APP不同血清型菌株在MHB、BHI中生物膜形成能力较强，其次为TSB，而在LB和PPLO中生物膜形成能力较弱，总体趋势为MHB>BHI>TSB>LB>PPLO(图2A)；从不同血清型菌株比较结果看，血清3型、4型、7型、12型参考菌株和分离株JS生物膜形成能力较强，而其他菌株形成能力较弱(图2B)。

A.APP菌株在5种培养基中形成生物膜的比较；B.APP血清1型～12型参考菌株及2株分离株JS和JL形成生物膜的比较；1～12.参考菌株1～12；JS.分离株JS；JL.分离株JL；超过2×DC表示强生物膜形成能力A.Comparison on the biofilm formation of APP strains in the 5 culture media;B.Comparison on the biofilm formation of APP serovars 1-12 reference strains strains and isolates JS and JL;1-12.Reference strains of A.pleuropneumoniae showed as 1-12;JS.Isolates strain JS；JL.Isolates strain JL；The OD590 values larger than 2×DC means strong biofilm formation ability.

2.3 药敏试验结果

利用药敏纸片法测定APP血清1型～12型参考菌株及2个分离株的耐药性，结果显示，从不同抗菌药物类别看，所有菌株对万古霉素均耐药，对克林霉素表现中度耐药，6个菌株对红霉素中度耐药，其他抗菌药物对多数菌株均敏感；从不同血清型菌株看，血清7型和8型菌株对5种抗菌药物表现耐药性，而其他菌株仅对2种～3种抗菌药物表现耐药性(万古霉素、克林霉素、红霉素)。

2.4 Apx毒素分泌测定结果

APP血清1型菌株以同样菌量分别转接至BHI、LB、MHB、PPLO和TSB培养液中，经16 h培养后细菌OD 600 nm测定结果与2.1生长曲线测定结果一致，即BHI中生长最好，其次为TSB，而在MHB、LB和PPLO中生长较差，而且除TSB外的其他培养基中添加5 mmol/L CaCl2后细菌生长能力稍高于未添加CaCl2的培养基(图3)。所有培养上清液浓缩至相同的倍数，即20 mL浓缩至0.5 mL。Western blot检测结果显示，ApxⅠ毒素蛋白在生长不良的培养基MHB、LB和PPLO中表达量显著高于生长良好的培养基BHI和TSB，特别是BHI中未检测到明显ApxⅠ蛋白条带，而且添加5 mmol/L CaCl2后ApxⅠ毒素分泌量显著增加(图4)。

BHI0、LB0、MHB0、PPLO0和TSB0表示在相应培养基中未添加CaCl2；BHI5、LB5、MHB5、PPLO5和TSB5表示在相应培养基中添加5 mmol/L CaCl2;所有测定时间点的OD 600 nm值均为多个测定值的平均数

M.蛋白分子质量标准;1、2.LB；3、4.TSB；5、6.MHB；7、8.BHI；9、10.PPLO；1、3、5、7、9为不添加CaCl2的培养液；2、4、6、8、10为添加5 mmol/L CaCl2的培养液

3 讨论

APP是一种营养要求比较苛刻的病原细菌，自感染猪病料组织中分离成功率较低[1]。张蓉蓉等[13]报道显示，将免疫磁珠技术应用于自病料中分离APP可显著提高其分离率。筛选适于APP生长的培养基将有助于其分离培养，且为病原增殖和疫苗制备提供参考。添加NAD的TSB培养基广泛应用于APP的分离培养，本试验通过比较5种培养基结果也显示，不同血清型APP菌株在TSB中均生长良好，在BHI中显示更好的生长能力，而在MHB、LB和PPLO中均生长不良。本试验虽然仅使用了3种血清型菌株进行生长能力评价，但生长曲线结果提示，不同血清型菌株总体培养特性基本一致。

研究显示APP不同血清型菌株具有形成生物膜的能力[14]，但由于细菌形成生物膜受到多种因素的影响，因而不同文献报道的结果并不一致，如Kaplan J B等[15]报道在测定的APP 15个血清型参考菌株中仅血清5b和11型可形成生物膜；而Labrie J等[16]报道APP血清1、3、4、5a、12和14型均可形成生物膜，而且APP血清1型在BHI-B(Oxoid公司)中较BHI-A(BD Difco公司)中生物膜形成能力强。本试验结果显示,APP不同血清型菌株在MHB、BHI中生物膜形成能力较TSB、LB和PPLO强，而且血清3、4、7型和12型参考菌株生物膜形成能力较强。因而多种因素如细菌菌株、血清型、生长状态、生长时相、培养材料、培养基、培养条件等均影响细菌生物膜形成能力[14]。

通常认为细菌形成生物膜是其适应外界环境、提高耐药性等的一种机制，因而细菌生物膜形成与耐药性密切相关[17]。研究显示，APP生物膜形成后对抗菌药物的敏感性大大降低，对抗菌药物的MIC值较未形成生物膜的细菌可提高100倍～30 000倍[14]；而且对APP分离株研究发现形成生物膜的APP菌株具有传递耐药性相关基因的能力[9]。由于本试验所用菌株对测定的大多数抗菌药物均比较敏感，未发现生物膜形成与耐药性具有显著相关性，但随着APP临床耐药性菌株的逐渐增加，这种相关性将会愈加明显。

Apx毒素是APP最重要毒力因子之一，也是研制APP亚单位疫苗的主要组分[4]，筛选和优化APP菌株分泌Apx毒素的培养条件为疫苗研制及毒素生物学研究提供参考。Jarma E等[11-12]研究显示,APP培养过程中氧气浓度对ApxⅠ和ApxⅡ的分泌无显著影响，而细菌生长时相显著影响Apx毒素的分泌水平，即细菌生长对数晚期和平台早期毒素分泌水平最高。Dao H T等[10]通过比较PPLO和Columbia Broth(CB)以及添加不同Ca2+浓度,显示利用PPLO培养基添加20 mmol/L CaCl2可获得最大分泌量的Apx毒素。我们研究结果显示，ApxⅠ毒素蛋白在生长不良的培养基MHB、LB和PPLO中表达量显著高于生长良好的培养基BHI和TSB，而ApxⅡ毒素蛋白刚好相反，在生长良好的培养基BHI和TSB以及MHB中可看到明显的蛋白条带,而在生长不良的LB和PPLO中未检测到明显的ApxⅡ蛋白条带；而且添加5 mmol/L CaCl2后ApxⅠ和ApxⅡ毒素蛋白分泌量均显著增加。我们还发现，如Dao等报道在PPLO培养基中添加20 mmol/L CaCl2时，培养基中形成Ca2+沉淀物导致其浑浊，难以通过测定OD 600 nm值来判定其生长繁殖情况，而在添加5 mmol/L CaCl2时培养基中未见明显的沉淀物。