白及/魔芋复合凝胶体系的构建及性能表征

李彦军,窦 欣，2,赵倩楠,张方剑,赵心梦,严维华,边瑞娜,姚来君,毛跟年*

(1.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安 710021；2.陕西能源职业技术学院，陕西咸阳 712000)

敷料是一种对伤口愈合过程保持长期的清洁、杀菌、保护和提供治愈环境的止血材料[1]，在人体和动物临床方面具有广泛的进展。常用的伤口敷料有纱布[2-3]、绷带[4]、泡沫[5]、海绵[6-7]等，但传统敷料对伤口的愈合只起到保护免受二次伤害，对伤口愈合没有较大的促进作用。随着对创伤愈合过程研究的不断深化，利用天然聚合物多糖材料具有的生物相容性强[8]、易吸收、愈合受伤组织能力[9]、易降解等的特点，在生物敷料工程材料的研制和开发中都显示了良好的应用前景。

白及多糖(Bletillastriatapolysaccharide,BSP)是一种含有多羟基的甘露聚糖[10]，是从植物白及中提取的主要水溶性多糖，由1,4链甘露醇残基和1,4链葡萄糖残基键合而成的聚合物[11]。研究发现BSP具有抗炎[12]、抑菌[13]、清除自由基、抗肿瘤和止血[14]等特点。结合BSP的药理学活性，广泛的应用于新型水凝胶系列生物医用敷料，加速愈合的过程[15]。Xiang J等[16]制备了一种基于聚乙烯醇的BSP型水凝胶，以鼠的肝出血和断尾为模型，在伤口失血量和止血方面表现优异的特性。Zhang C等[17]制备了用于修复小鼠皮肤损伤的白及多糖水凝胶作为创面愈合贴片，以小鼠全切性皮肤创面为试验对象，结果显示可显著改善创面收缩、上皮形成、胶原沉积和炎症反应。然而，单纯的BSP止血敷料存在机械性能差等问题，限制着BSP在该领域的进一步发展。魔芋葡甘聚糖(Konjac glucomannan,KGM)作为同系列甘露聚糖的一部分，由D-甘露糖和D-葡萄糖通过β-1，4糖苷键键合而成[18]，具有良好的凝胶性、成膜性、高吸水性、无毒性和热稳定性。在碱化和加热处理的条件下，可形成高稳定性的不可逆凝胶，该凝胶具有良好的吸湿、保湿功能[19]。利用KGM的生物学特性，提供基底材料高弹性和高孔隙率，吸附伤口创面的渗出物，提供一个稳态的环境，促进受伤创面的保湿和创伤表面药物的释放[17]。Xie Y等[20]制备一种羧基化的魔芋葡甘聚糖止血海绵，可加速皮肤损伤组织的再生。鉴于BSP和KGM生物材料的优势，将其制备成一种新型凝胶止血敷料，以期提高材料的弹性和抑菌性等性能。本文通过对BSP/KGM凝胶的制备工艺探索，研究凝胶敷料的结构和抑菌性能，以期为BSP/KGM凝胶敷料的制备优化提供可靠的支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂 魔芋精粉，分子质量200 ku～2 000 ku，湖北一致魔芋生物科技有限公司产品；白及(产地云南)，北京同仁堂医药有限公司产品；头孢曲松钠，Oxoid产品；氯仿、正丁醇、950 mL/L乙醇、氢氧化钠(NaOH)，天津市科密欧化学试剂有限公司产品。

1.1.2 仪器 微机控制电子万能试验机(CMT4304)，深圳市三思试验仪器有限公司产品；台式扫描电镜(Phenom Pro)，Phenom公司产品；红外光谱仪(VERTEX70)，Bruker公司产品；冷冻干燥机(FD5-2.5)，SIM公司产品；集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S)，郑州杜甫仪器厂产品。

1.2 方法

1.2.1 制备方法 将0.5 g白及和魔芋精粉以3∶1加入50 mL蒸馏水中，搅拌均匀，加入NaOH进行混合，置于热水浴中1 h，取出在室温下放置至常温后进行冷冻干燥处理，得到制备的BSP/KGM凝胶。

1.2.2 测试方法

1.2.2.1 吸水率测定 取一定量的样品精密称定后记为W0，放入盛有9 mg/g生理盐水的烧杯中，分别在1、3、5、10、20 min时进行称重，并记为Wt，凝胶样品吸水率公式为：

吸水率(%)=[(Wt-W0)/W0]×100%

1.2.2.2 机械强度测定 将样品裁成哑铃状，测量其高度以及厚度后，夹入仪器中进行测量。室温下进行测定，每个样品平行测定3次。

1.2.2.3 水蒸气透过量测定 使用100 mL的锥形瓶放入50 mL蒸馏水，称量瓶子和水的总重记为W1，在瓶口的边缘涂上凡士林，然后将冷冻干燥后的样品放在瓶口上并将瓶口周围缠上保鲜膜后进行密封，放在干燥器中24 h后，取下水凝胶样品，称量试剂瓶和蒸馏水的总重记为W2，平行测试3次，样品透气率公式：

透气量ε=(W1-W2)/(t·πr2·h)

公式中t表示测试时间(h)，r表示样品半径(m)，h表示样品厚度(m)。

1.2.2.4 红外光谱分析 将样品置于真空干燥箱中干燥，用红外漫反射的方法在波数为4 000 cm-1～600 cm-1、分辨率为0.4cm-1范围内进行扫描。

1.2.2.5 X-射线衍射分析 将样品冷冻干燥后，放于X-射线衍射仪中进行分析，扫描角度在10°～70°范围，扫描速度为4°/min进行衍射分析。

1.2.2.6 扫描电子显微镜分析 样品置于冷冻干燥机中冷冻干燥24 h后，将裁剪好的干燥样品，经喷金处理后，用Phenom Pro型扫描电镜对样品进行扫描。

1.2.2.7 抑菌性能检查 将样品用打孔器制成直径为0.5 cm的圆片，分别放入培养好的大肠埃希氏菌及金黄色葡萄糖菌培养皿中，并放入等大小的头孢曲松钠试纸作为阳性对照，在37 ℃下培养36 h后观察结果。

2 结果

2.1 制备工艺优化

通过碱浓度、温度和白及多糖与魔芋葡甘聚糖的用量比例为指标来确定BSP/KGM凝胶的最佳制备工艺。

2.1.1 氢氧化钠浓度的影响 将BSP与KGM以1∶1混合后加入不同浓度的氢氧化钠，在同一温度下进行凝胶化反应，经冷冻干燥后对其吸水率、应力及透气量的测定。结果见图1，凝胶化时间随氢氧化钠浓度的增加而缩短，说明KGM经脱乙酰，加快了凝胶的形成，碱浓度越大，脱乙酰反应越迅速。当吸水率在碱的浓度为2 mg/g时，凝胶化效果最好，在氢氧化钠浓度达2 mg/g之后，随着氢氧化钠浓度的增大，吸水能力逐渐降低。氢氧化钠的浓度对最大应力影响不太大。因此，BSP/KGM凝胶中氢氧化钠的最佳碱配比为2 mg/g。

图1 NaOH浓度对凝胶的凝胶化时间、透气量、吸水率和最大应力的影响

2.1.2 温度影响 将BSP/KGM凝胶以1∶1混合后加入2 mg/g的氢氧化钠，在不同温度下进行凝胶化反应，经冷冻干燥后对其进行吸水率、应力及透气量的测定。结果见图2，随着温度的增加，凝胶化时间逐渐缩短，但温度对其他性能的影响较小，温度对凝胶体系形成凝胶的时间有影响。因此，BSP/KGM凝胶最佳凝胶温度为70 ℃。

图2 温度对凝胶的凝胶化时间、透气量、吸水率和最大应力的影响

2.1.3 BSP与KGM的比例的影响 将BSP与KGM以不同比例混合后加入2 mg/g的氢氧化钠，在70 ℃下进行凝胶化反应后冷冻干燥，得到凝胶并对其进行吸水率、应力及透气量的测定。结果见图3，当BSP与KGM的比例为3∶1时，机械强度最好；BSP与KGM的比例为4∶1时，机械强度最差；可能是BSP/KGM凝胶体系中，其机械强度来自于KGM，KGM所占比例越大，凝胶体系机械强度最好，随着BSP比例的增加，凝胶整体机械强度逐渐减弱。吸水率及透气量在BSP与KGM比例1∶3、2∶1与3∶1范围内参数变化较小。因此，BSP与KGM最佳比例选择为3∶1。

图3 BSP与KGM的比例对凝胶的透气量、吸水率和最大应力的影响

2.2 性能表征

2.2.1 结构分析 将KGM、BSP和BSP/KGM凝胶红外谱图进行对比分析，结果见图4，在1 629.78 cm-1处出现了C=0伸缩振动所产生的强吸收峰，表明KGM中含有的羟基和羧基亲水基团，KGM分子的特征峰位于671.2 cm-1和3 589.37 cm-1处，代表了KGM中的基本单元，在1 629.78 cm-1处有特征峰，说明有乙酰基存在，乙酰基是KGM所特有的，在1 630 cm-1左右有吸收峰，说明有羧基存在。KGM在3 494.86 cm-1和1 095.52 cm-1处分别出现-OH和C-O的伸缩振动峰，两张图谱进行对照表明，BSP红外图谱中C-O的伸缩振动峰与KGM中C-O的伸缩振动峰位置相同，证明了BSP与KGM有着极其相似的结构。

图4 KGM、BSP、BSP/KGM凝胶红外谱图

将KGM、BSP和BSP/KGM凝胶XRD进行对比分析，结果见图5，纯KGM的2θ在26.984°、42.641°处有很强的干涉，对应的面间距d数值为3.834 0、2.460 2。BSP的2θ在17.723°、23.158°处有较强的干涉，在33.465°、37.248°处有干涉，对应的面间距d数值为5.806 6、4.456 4、3.106 9和2.800 9。BSP/KGM凝胶2θ在13.971°、24.924°处有较强的干涉，27.651°、31.002°有干涉，对应的面间距d数值为7.354 9、4.145 1、3.743 1和3.346 9。与纯KGM和BSP相比，BSP/KGM凝胶混合后，可明显的看到在13.971°时，有较强的峰，表明在13.971°的峰应为NaOH对KGM脱乙酰时的残留。BSP衍射特征峰23°左右，但是与KGM的衍射峰重叠，证明了BSP与KGM的结构极为相似。

图5 KGM、BSP、BSP/KGM凝胶XRD图

由以上两项可以证明，BSP与KGM在结构上相似，在进行了混合制备凝胶过后，BSP与KGM进行互穿形成网状结构，但本身性质未发生变化。

2.2.2 电镜扫描分析 KGM凝胶与BSP/KGM混合后的电镜扫描显示出孔隙状结构，结果见图6，由图6b～d可清晰的看到孔隙的完整结构，最大孔径300 μm左右，孔的形成是材料具有吸收性及透气性的前提，孔隙越多，连通性越好，越有利于伤口的愈合。孔隙率高及连通性能够使干性凝胶具有更好的吸水性，能够吸收伤口渗出的液体或伤口出血，将液体吸收在孔隙中，保持创面干燥，防止渗出液污染伤口引起细菌感染，并能维持伤口的湿润环境，让伤口更容易愈合。从图6d可以看出，BSP和KGM混合后的干燥凝胶孔隙相对均匀，大小一致，为BSP/KGM凝胶具有良好的吸水性、透气性提供良好的空间结构。

a.BSP/KGM凝胶实物图；b.KGM凝胶；c、d.BSP/KGM凝胶A.BSP/KGM gel physical diagram；b.KGM gel；c，d.BSP/KGM gel

2.2.3 抑菌试验

2.2.3.1 BSP/KGM凝胶对金黄色葡萄球菌抑菌效果 以纯KGM作为阴性对照，样品对金黄色葡萄球菌抑菌结果见图7，图7b无抑菌圈，表明纯的KGM对金黄色葡萄球菌无抑菌效果，头孢曲松钠作为阳性对照，抑菌效果最为明显，当样品加入白及后，图7d出现抑菌圈，表明白及对金黄色葡萄球菌有抑菌效果，抑菌圈直径为9 mm，且白及的含量越多，抑菌效果越明显。

A.阳性对照；b.纯KGM；c.BSP/KGM 1∶1混合；d.BSP/KGM 4∶1混合A.Positive control；b.Pure KGM；c.BSP/KGM 1∶1 mixed；d.BSP/KGM 4∶1 mixed

2.2.3.2 BSP/KGM凝胶对大肠埃希氏菌抑菌效果 样品对大肠埃希氏菌抑菌结果见图8，头孢曲松钠作为阳性对照，抑菌圈直径25 mm，抑菌效果最明显，图8b周围无抑菌圈，表明纯KGM对大肠埃希氏菌并无抑菌效果。当样品加入白及后，图8d出现抑菌圈，证明白及有抑菌效果，且白及的含量越多，对大肠埃希氏菌抑菌效果越显著。

a.阳性对照；b.纯KGM；c.BSP/KGM 1∶1混合；d.BSP/KGM 4∶1混合A.Positive control；b.Pure KGM；c.BSP/KGM 1∶1 mixed；d.BSP/KGM 4∶1 mixed

结果表明，纯KGM并无抑菌效果，而加入白及之后出现明显抑菌圈，说明白及有很好的抑菌效果，而且白及对大肠埃希氏菌的抑菌效果明显优于金黄色葡萄球菌。

3 讨论

通过冻融制备工艺技术，采用单因素法确定制备的BSP/KGM凝胶最佳制备工艺，当氢氧化钠用量为2 mg/g，温度为70 ℃，BSP与KGM质量比3∶1时，凝胶的吸水率、透气量、机械强度和抑菌效果等方面均有较理想的结果。采用此方法制备的凝胶能够使伤口保持适宜的湿润度，能够使渗出液迅速吸收，为制备的BSP/KGM凝胶在止血抑菌敷料的研究和应用提供了科学依据。