华支睾吸虫γ-谷氨酰转移酶7基因的原核表达及反应原性分析

金程佳，马晓晓，常巧呈，高俊峰，王春仁

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319)

华支睾吸虫病(Clonorchiasis)主要是由于误食含华支睾吸虫(Clonorchissinensis)囊蚴的淡水鱼、虾所造成的人兽共患寄生虫病。华支睾吸虫成虫主要寄生于人、犬、猫及猪等多种哺乳类动物的肝胆管及胆囊中[1]，引起胆道阻塞、胆囊炎、肝硬化，甚至胆管癌等多种严重的肝胆管疾病[2]。在胆管癌发生的病例中每10万例中就有约25例～35例是由华支睾吸虫感染导致的[3]。华支睾吸虫被国际癌症组织列入Ⅰ类生物性致癌影响因子[4]。据估计，全世界目前约有2亿人会存在感染华支睾吸虫的风险，约1 500万人被华支睾吸虫感染[5]，极大地威胁到人类健康及公共卫生安全。我国感染人数达到1 300万[6]，以广东、广西、黑龙江最为严重[7]。目前，对于华支睾吸虫病的诊断仍然主要采用虫卵检测法，现有免疫诊断方法的效果准确性不高且成本较高[8]，不适于广泛使用。筛选出可以检测华支睾吸虫的抗原蛋白并建立免疫学诊断方法十分重要。

寄生虫在宿主体内寄生过程中，会释放一种可溶性抗原——排泄分泌产物 (excretory secretory products，ESPs)。它是由肠上皮、表皮及其他排泄分泌器官向宿主环境释放产生的[9]，具有较好的免疫反应原性，可以引发机体免疫应答，是临床重要的诊断候选抗原。γ-谷氨酰转移酶7 (gamma-glutamyltransferase 7，GGT7)在华支睾吸虫发育的各个时期均呈现高度表达，其蛋白含量在肝炎、阻塞性黄疸、胆道感染、胆石症、急性胰腺炎、黄疸性肝炎、肝硬化等多种肝胆系统疾病时亦明显升高[10]，所以γ-谷氨酰转移酶可预测肝胆功能系统疾病，并且有希望应用于临床诊断华支睾吸虫病。基于此，本研究拟对华支睾吸虫ESPs中的主要成分γ-谷氨酰转移酶7(GGT7)进行原核表达及反应原性分析，旨在探究其作为诊断抗原的潜能，为华支睾吸虫病诊断试剂的研发提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫体及血清 华支睾吸虫的成虫、人工感染并检测出华支睾吸虫虫卵的兔血清(阳性血清)、未感染华支睾吸虫兔血清(阴性血清),均来自黑龙江八一农垦大学寄生虫病研究室。

1.1.2 主要试剂 RNAprep pure Tissue Kit、DNA Marker、ExTaq酶，宝生物工程(大连)有限公司产品；TIANamp Genomic DNA Kit，天根生化科技有限公司产品；Hind Ⅲ和XhoⅠ，赛默飞科技有限公司产品；大肠埃希氏菌DH5α、BL21 (DE3) ，北京全氏金生物技术有限公司产品；HRP标记的鼠抗兔IgG，AB Clonal公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 低温离心机，Eppendorf公司产品；蛋白半干转膜仪、紫外凝胶成像仪，Bio-Rad公司产品；PCR仪，TaKaRa公司产品；涡旋振荡器(QL-901)，海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品；SK-O180-E型水平摇床，上海卡耐兹实验仪器设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 GGT7基因的生物信息学分析 将目的基因序列置入Uniport中，分析其所行使功能、所属蛋白家族、结构域等；利用DNA Star(7.1) 软件中的Protean对蛋白二级结构 (α-螺旋和β-折叠等) 及抗原表位进行预测分析；利用在线软件ExPASy (https://www.expasy.org/) 分析目的蛋白的疏水性；蛋白跨膜区的分析选用SignalP 4.1Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)[11]；用ExPASy (https://swiss model.expasy.org/) 分析蛋白的三级结构[12]。

1.2.2 引物设计及pET-32a-GGT7重组质粒的构建与鉴定 根据GenBank中公布的GGT7基因序列，利用Primer 5[13]进行分析设计特异性引物，上游引物GGT7-U：5′-AAG CTTGC CCC CAT GGT GCA GTC ATT TCT G-3′；下游引物GGT7-F：5′-CTC GAGTTA AAA TTG TGC GGA ATT CCA TG-3′，下划线区域部分为Hind Ⅲ和XhoⅠ的酶切位点，预期基因片段大小为1 773 bp，引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。

从液氮中取出保存的华支睾吸虫虫体，于研钵中充分研碎，按照试剂盒操作提取虫体总RNA。以总RNA为模板进行反转录，得到的cDNA，置于-80 ℃保存。以cDNA为模板，经PCR扩增得到GGT7基因，扩增的条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共32个循环；72 ℃ 7 min。将所有PCR产物按照胶回收试剂盒说明书的操作进行回收，并将其克隆至pMD18-T载体，构建pMD18-T-GGT7克隆载体。经菌液PCR鉴定后，阳性质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司鉴定，用Hind Ⅲ和XhoⅠ同时对pMD18-T-GGT7阳性质粒及pET-32a空载体质粒进行双酶切，构建重组质粒pET-32a-GGT7，经菌液PCR鉴定后，生工生物工程(上海)股份有限公司测序，即可置-80 ℃冰箱冷冻保存。

1.2.3 重组蛋白表达的鉴定 将鉴定正确的重组质粒pET-32a-GGT7转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞中，置于具有氨苄抗性的LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养至OD600 nm值约为0.6，加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG诱导重组菌表达6 h，收集诱导后的菌体，1 200 r/min离心去上层培养液，将下层沉淀加入15 mL的破菌液重悬混匀，将其放在冰板上，置于超声破碎仪上进行超声破碎，1 200 r/min离心2 min后，分别取100 μL上清与沉淀，加入20 μL的蛋白上样缓冲液，置于100 ℃ 金属浴加热10 min，待其冷却后用于SDS-PAGE鉴定。

SDS-PAGE电泳后，将胶块放置在0.2 mol/L KCl溶液中静置5 min，待能够清晰的看到银白色条带后，用干净的梳子切下目的条带所在的位置，用PBS清洗3次，碾碎后放入2 mL离心管，加入1 mL PBS后，置于-20 ℃冰箱中反复冻融3次，经过高速离心后吸取上清即为纯化后的蛋白。将纯化好的蛋白湿转于硝酸纤维素薄膜上，用50 g/L的脱脂奶粉浸泡2 h对其进行封闭，以人工感染的兔华支睾吸虫阳性血清作为一抗 (1∶150)，以HRP标记的鼠抗兔 IgG为二抗 (1∶4 000)，Western blot鉴定重组蛋白的表达。

2 结果

2.1 GGT7基因的生物信息学分析

用生物学软件DNA Star(7.1)Protean分析预测目的蛋白的二级结构和抗原表位，发现主要有7个α-螺旋，分别位于2-17、28-38、132-143、211-234、272-285、303-323、446-455位氨基酸；有6个主要的β-折叠，分别位于78-104、361-370、411-425、429-438、494-503、517-526位氨基酸；柔韧性在105-108、240-243、373-376位氨基酸较好 (图1A)；B细胞抗原表位主要位于59-89、163-191、238-274、287-361、46-551位氨基酸 (图1B)，推测GGT7可能具有结合抗体的能力。

用在线软件ExPASy分析蛋白的疏水性，大部分曲线位于0点以下，预测目的蛋白为包涵体表达 (图1C)，利用在线软件SWISS MODEL预测该蛋白的三级结构 (图1D)。生物信息学分析发现，该蛋白具备较多的B细胞抗原表位，推测其具备免疫反应原性。

A.二级结构分析；B.GGT7 B细胞表位预测；C.GGT7疏水性分析；D.GGT7三维结构预测

2.2 重组质粒的构建与鉴定

以华支睾吸虫的cDNA为模板，用设计的特异性引物对其进行PCR，扩增得到GGT7基因，将所有产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，在1 700 bp左右的位置出现目的条带 (图2A)，将其与pMD18-T载体进行连接，随后克隆至大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞中再次构建重组质粒pMD18-T-GGT7。测序得到GGT7基因为1 773 bp，A+T含量为51%，与GenBank中的华支睾吸虫GGT7完整基因的核苷酸 (RJW59997.1) 序列的同源性为99.98%，DNA Star软件预测GGT7基因可以进行正常翻译。测序鉴定正确后，构建重组质粒pET-32a-GGT7，经Hind Ⅲ和XhoⅠ酶双酶切及测序鉴定，在3 200 bp处有pET-32a载体条带，在1 700 bp左右出现酶切后目的基因条带，与预期结果完全相符 (图2B)，表明pET-32a-GGT7重组质粒准确构建。

A.GGT7;B.重组质粒;M.DNA 标准DL 2 000;M1.DNA标准DL 5 000；1.GGT7基因；2.用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ 酶切质粒A.GGT7;B.Recombinant plasmid;M.DNA Marker DL 2 000;M1.DNA Marker DL 5 000;1.GGT7 gene;2.Digestion of plasmid by Hind Ⅲ and Xho Ⅰ

2.3 重组蛋白的表达纯化与鉴定

用IPTG诱导测序正确的pET-32a-GGT7阳性菌液。SDS-PAGE结果表明，目的蛋白是以包涵体形式表达，目标条带出现在70 ku处，与理论值一致(图3)。凝胶切割纯化后，得到单一目的条带。Western blot结果表明，纯化蛋白能与兔阳性血清反应，与阴性血清不反应(图4)，表明蛋白质显示出良好的反应原性。

M.蛋白分子质量标准;1.未诱导重组pET-32a-GGT7；2.用IPTG诱导重组pET-32a-GGT73;3.重组pET-32a-GGT7经IPTG诱导表达产物上清液；4.pET-32a-GGT7表达产物经IPTG诱导沉淀

M.蛋白分子质量标准；1.兔华支睾吸虫阳性血清；2.阴性对照

3 讨论

华支睾吸虫感染后主要与肝脏和胆道系统疾病有关，特别是与胆管癌相关[14]。Kato-Katz技术[15]应用于新鲜粪便样本，粪便中检出虫卵是诊断华支睾吸虫感染的金标准，也是目前应用最广泛的诊断方法，具有简单、成本低，能够量化感染强度的优点。该方法的缺点是灵敏度低，特别是在检测低强度感染时，若在胆道阻塞期间，粪便中则无法检测到虫卵。华支睾吸虫病抗原检测自20世纪70年代末引入ELISA就得到广泛应用[16]。由于存在交叉反应，所以使用粗抗原进行ELISA血清学诊断并不理想。

华支睾吸虫病对公共卫生的重要性未引起重视，所以感染和疾病数量不断增加。过去140年来对华支睾吸虫病的临床和流行病学研究[17]有助于加深对寄生虫、中间宿主和疾病的理解。然而，对华支睾吸虫生物学和华支睾吸虫病防治的研究落后于钩端螺旋体病和许多其他寄生虫病。虽然华支睾吸虫感染与胆管癌之间的关系在过去几年已经得到初步证实[18]，但其机制尚未完全阐明，也阻碍了诊断和预防。此外，目前对于国家、区域和世界范围的华支睾吸虫病所造成的影响也仅是推测。例如，目前越南还没有进行全国性的调查，因此估计这个国家感染华支睾吸虫的人数是不准确的。我国全国抽样调查只计算省级的患病率。时至今日，华支睾吸虫γ-谷氨酰转移酶(GGT)在人、畜肾脏中表达是最高的，其次为胰脏和肝脏。正常哺乳动物血清中γ-谷氨酰转移酶主要来自于肝脏，当肝内合成亢进或胆汁排出受阻时，血清中γ-谷氨酰转移酶就会明显升高[19]。因此，γ-谷氨酰转移酶可用于检测多种肝脏系统的疾病。而GGT7重组蛋白作为γ-谷氨酰转移酶家族中的一个成员，在华支睾吸虫繁殖发育的各个重要阶段不同时期都已经证实其存在。我们首次成功地表达了GGT7重组蛋白，Western blot结果显示，该蛋白可以与华支睾吸虫阳性血清特异性结合，表明其具有良好的反应原性。该蛋白具有临床诊断华支睾吸虫病的潜力，为研发华支睾吸虫病免疫诊断试剂奠定了基础。