杂交构树青贮对务川白山羊瘤胃微生物区系的影响

李世歌 ， 陈光吉 ，2， 李小冬 ， 邹晓敏 ， 何润霞 ， 张 坤 ，尚以顺 ， 张 蓉 ， 熊先勤 ，2 ， 王子苑 ， 冉 贤

（1.贵州省农业科学院草业研究所，贵州贵阳 550006；2.贵州阳光草业科技有限责任公司，贵州独山 558200；3.务川仡佬族苗族自治县畜牧水产服务中心，贵州务川564300；4.贵州务川科华生物科技有限公司，贵州务川564300）

近年来，我国居民对畜禽产品的消费量需求增长强劲， 特别是牛羊肉在饮食结构中比例增加，促进了畜牧业，尤其是牛羊产业快速发展，加之新冠肺炎疫情和中美贸易摩擦影响，国际大宗饲草饲料价格上涨，使我国饲草和蛋白质饲料资源缺乏问题愈显突出。因此，开发新型蛋白质粗饲料资源，发展节粮型畜牧业已是迫在眉睫。 构树（Broussonetia papyrifera）又名楮桃，被子植物门双子叶植物纲荨麻目桑科构树族构属的落叶乔木。中科院通过种间杂交育种培育的杂交构树，具有速生、抗逆强、轮伐期短、高产的特点（王丽，2019），是目前在我国推广种植较为广泛的新品种。 杂交构树营养价值高，含有丰富的粗蛋白质、粗脂肪、氨基酸、维生素和微量元素，其叶片粗蛋白质含量高达19.22%~26.10%，全树综合利用枝叶混合物粗蛋白质含量为17%左右（张红等，2020；刘祥圣等，2019；左鑫等，2018），与苜蓿干草相当。 此外，构树叶中含有黄酮类化合物、生物碱、挥发油类、不饱和脂肪酸等生物活性物质，可在动物体中发挥抗菌、抗炎、增强免疫力、抗氧化等功能性作用（Dong 等，2020；Park 等，2016）。可见，杂交构树是一种极具开发价值的高蛋白质非常规木本饲料。

瘤胃是反刍动物特有的消化器官， 内含大量的瘤胃微生物， 其使反刍动物能够高效消化利用植物性蛋白、多糖和纤维素等，为机体提供必要的营养物质（崔浩然等，2021；杨艳等，2020）。瘤胃微生物的种类和丰度受动物的品种、年龄、饲料、生理阶段、健康状况等多种因素影响，其中饲粮组成和结构是瘤胃微生物最大的影响因素之一 （马健等，2020）。董春晓等（2019）研究表明，不同粗饲料改变了湖羊的瘤胃细菌群落结构， 相比于玉米秸秆、玉米芯和葵花籽壳，油菜秸秆使瘤胃微生物的物种丰富度和多样性更高。 李希等（2021）的研究结果显示， 适量提高日粮中纤维水平能够促进羔羊瘤胃中部分纤维降解菌的增殖。 陈丽娟等（2020）在不同比例的苜蓿和构树为底物的瘤胃液体外发酵试验中发现， 高比例构树提高了变形杆菌门的丰度，高比例苜蓿提高了广古菌门丰度。圣平等（2021）在日粮中添加杂交构树饲喂湖羊，其瘤胃中拟杆菌门的相对丰度升高， 厚壁菌门的相对丰度则降低。研究表明，瘤胃微生物的变化与瘤胃发酵和生产效率密切相关 （Li 等，2019； 王海荣，2006；Shabat 等，2016）。然而，不同比例杂交构树青贮和青贮玉米的混合日粮对肉羊瘤胃微生物群落结构的影响还鲜见报道。 本试验旨在研究杂交构树青贮替代不同比例的青贮玉米对务川白山羊的瘤胃微生物群落结构的影响， 为杂交构树青贮在肉羊养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 杂交构树由务川县桃符构树产业孵化园提供， 刈割高度1.5 m 左右， 留茬高度20 cm 左右，第一茬刈割，粉碎至2 ~ 3 cm，制作为裹包青贮于常温条件下发酵60 d 后逐包取用，每包重约50 kg。 试验羊采购自务川县养殖企业，系贵州地方山羊品种。

1.2 试验设计 选取64 只4 月龄体重为（12.40±2.00）kg 的健康务川白山羊， 随机分为 4组，每组 16 只羊（公母各半，分开饲养）。CS 组（对照组）不添加杂交构树青贮；LBP 组杂交构树青贮替代20%青贮玉米；MBP 组杂交构树青贮替代50%青贮玉米；BPS 组杂交构树青贮替代100%青贮玉米。各组日粮精粗比一致，杂交构树青贮和青贮玉米的比例为唯一变量。 日粮组成与营养水平见表1。

表1 日粮组成及营养水平（干物质基础） %

1.3 饲养管理 试验羊采用高床羊舍舍饲，人工饲喂。试验前对羊舍全面清扫消毒，试验羊逐只称重、驱虫、打耳标。 每天 8：00 和 17：00 定时饲喂，精料和粗料混合均匀后饲喂，自由饮水，每天记录各组饲粮添加量和前一天剩料量。 预饲期15 d，试验期172 d。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 瘤胃液的采集与处理 正式期最后1 d 晨饲前，每组随机选择6 只试验羊（公母各3 只），用真空泵瘤胃液采集器（2XZ-1，上海凯清）经口腔采集瘤胃液20 mL，经4 层无菌纱布过滤后，-80 ℃冷冻保存用于瘤胃微生物区系测定。

1.4.2 务川白山羊瘤胃微生物基因组DNA 提取和PCR 扩增 按照肠道内容物、粪便基因组提取试剂盒说明书对试验样品进行DNA 提取，提取的DNA 采用2.0%琼脂糖凝胶电泳进行质量检测，使用引物 341F，5‘-CCTACGGGNGGCWGCAG-3‘，805R，5‘ -GACTACHVGGGTATCTAATCC -3‘ 对16S rDNA 可变区（V3+V4）进行 PCR 扩增。 PCR 扩增采用 25 μL 程序：Pusion Hot start flex 2X Master Mix 12.5 μL，1 μmol/L 的上、 下游引物各 2.5 μL，DNA 模板 50 ng，补加双蒸水（ddH2O）至 25 μL；扩增条件：98 ℃持续 40 s 后进行 32 个循环， 依次为98 ℃ 30 s、98 ℃ 10 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，最后在72 ℃下延长10 min。PCR 扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目标片段进行回收，回收采用AMPure XT beads 回收试剂盒。

1.4.3 Miseq 测序 将样品送至联川生物技术有限公司运用Illumina MiSeq 平台进行Miseq 测序。

1.5 数据统计分析 试验数据采用EXCEL 2010初步处理后， 并采用SPSS 22.0 统计软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），Duncan’s 法进行多重比较，以P ＜0.05 作为差异显著性的判断标准。

2 结果

2.1 OTU 水平分析 基于 OTU 的 Venn 图显示，16S rDNA 基因测序共获得 6861 个 OTUs，4组之间共有 4413 个 OTUs，CS、LBP、MBP 及 BPS组特有的 OTUs 分别为 63、34、33、91（图 1）。

图1 基于OTU 水平的Venn 图

2.2 Alpha 多样性分析 由表2 可知， 按照97%的序列相似度水平， 各处理组的OTU 数目和α-多样性指数各异。 其中BPS 组、MBP 组务川白山羊瘤胃微生物的 OTU 数量分别比 CS 组高20.99%和 13.14%（P ＜ 0.05），Chao1 指数分别比CS 组高 20.83%和 12.15%（P ＜ 0.05）；BPS 组的Observed_species 指数和Shannon 指数分别比CS组高 27.23%和 9.73%（P ＜ 0.05）， 比 LBP 组高14.17%和 8.11%（P ＜ 0.05）；其他组间差异不显著（P ＞0.05）。 覆盖度反映样品的测序深度，所有样品覆盖度均在0.98 以上，表明本次测序结果可以反映样本的真实情况。

表2 瘤胃液细菌OTU 数目及Alpha 多样性指数

2.3 聚类分析 基于Unweighted UniFrac 的加权主坐标分析，主成分1（PCo1）贡献率为12.99%，主成分 2（PCo2）贡献率为 10.17%，CS 组和 BPS 组山羊瘤胃微生物菌群组成差异明显，饲喂相同日粮山羊的瘤胃微生物菌群可以很好的聚合在一起，微生物群落相似度较高（图2）；基于OTU 分析结果，利用非加权组平均法构建UPGMA 聚类树， 结果显示，LBP 组和 MBP 组细菌群落结构较相似，CS 组和BPS 组细菌群落结构差异较大（图3）。

图2 基于非加权距离的PCoA 分析

图3 基于非加权距离UPGMA 聚类树分析

2.4 瘤胃细菌群落组成分析

2.4.1 杂交构树青贮对务川白山羊瘤胃菌群门水平结构的影响 由表3 可知， 共检测到20 种菌门，包括拟杆菌门、厚壁菌门、疣微菌门、变形菌门、未分类菌门、黏胶球形菌门、丝状杆菌门、螺旋体门、暂定螺旋体门、迷踪菌门、蓝藻菌门、软壁菌门、互养菌门、浮霉菌门、放线菌门、广古菌门、SR1 门、绿弯菌门、酸杆菌门、装甲菌门。各组山羊瘤胃细菌主要为拟杆菌门、厚壁菌门、疣微菌门和变形菌门，4 种菌门合计占总细菌的91.37% ~92.26%。 与CS 组相比，随着杂交构树青贮比例的增加， 拟杆菌门的相对丰度呈先升高后降低的趋势， 且BPS 组的拟杆菌门相对丰度分别比CS 组和 MBP 组低 15.89%和 20.17%（P ＜ 0.05），MBP组暂定螺旋体门的相对丰度分别比CS、LBP 和BPS 组低 55.95%、48.61%和 44.78%（P ＜ 0.05）；LBP 组、MBP 组和BPS 组瘤胃液中酸杆菌门的相对丰度显著高于 CS 组（P ＜ 0.05）。 其他各组菌门的相对丰度无显著差异（P ＞0.05）。

表3 杂交构树青贮对务川白山羊瘤胃细菌群落门水平相对丰度的影响 %

2.4.2 杂交构树青贮对务川白山羊瘤胃细菌属水平结构的影响 由表4 可知，4 组山羊瘤胃液菌群共包含230 个属，其中有13 个菌属相对比例均占总菌数的1%以上，分别为普雷沃菌属、未分类拟杆菌属、未分类瘤胃球菌科、位置未定的亚门5属、未分类紫单胞菌科、未分类的拟杆菌目、理研菌属、未分类细菌、梭菌属、解琥珀酸菌属、瘤胃球菌属、克里斯滕森菌属、未分类的毛螺菌科。 BPS组瘤胃液中的普雷沃菌属相对丰度分别比CS 组和 MBP 组低 39.86%和 39.25%（P ＜ 0.05）；LBP、MBP 和BPS 组的未分类毛螺菌科相对丰度分别比 CS 组低 29.49%、44.70%和 38.25%（P ＜ 0.05）。

表4 杂交构树青贮对务川白山羊瘤胃细菌属水平相对丰度的影响 %

3 讨论

作为反刍动物的重要消化器官， 瘤胃主要依靠各类瘤胃微生物的代谢活动来实现饲料的消化和营养代谢。 瘤胃微生物的群落结构受多种因素影响， 其中日粮的变化是影响瘤胃微生物区系的重要因素。 Alpha-多样性反映微生物群落的丰富度和多样性，Observed_species 指数和Chao1 指数反映样本中菌群丰富度，数值越大，丰富度越高；Shannon 指数和Simpson 指数则用于估计瘤胃微生物的丰富度，Shannon 指数越大，Simpson 指数越低， 说明微生物群落多样性越高。 本试验中，MBP 组和 BPS 组的 OTU 数目、Observed_species指数和 Chao1 指数显著高于 CS 组，BPS 组的Shannon 指数显著高于 CS 组和 LBP 组， 而 LBP组和CS 组间的Alpha-多样性指标无显著差异，表明低比例的杂交构树青贮对务川白山羊的瘤胃微生物菌群多样性无显著影响， 但随着杂交构树青贮比例的提高， 瘤胃微生物群落结构呈现更高的多样性。圣平等（ 2021）在青贮杂交构树替代花生秸秆饲喂湖羊的试验中发现， 瘤胃中细菌群落的丰富度和多样性未见显著差异， 结果与本研究不同， 这可能是基础日粮组成和动物品种不同所致，说明杂交构树青贮的应用研究尚不充分。Beta多样性和聚类分析反映了各组样本间的相似性，分析可知， 各个样本大致根据试验处理不同而相互聚集在一起，CS 组与杂交构树青贮各组在主坐标分析图上距离较远， 说明高比例的杂交构树青贮改变了瘤胃细菌多样性。

反刍动物瘤胃中的优势菌门是拟杆菌门和厚壁菌门（Malaník 等，2020；Niu 等，2016）。 本试验中各组的拟杆菌门为第一优势菌群， 厚壁菌门的总量位居第二， 两者丰度之和占瘤胃微生物总量的80%以上，与前人研究结果一致（陈丽娟等，2020；李与琦等，2020）。 拟杆菌门主要参与蛋白质和非纤维素植物多糖的分解（Pitta 等，2014），厚壁菌门是反刍动物瘤胃中降解纤维素的主要微生物（Klieve 等，2016）。本研究中，随着日粮中杂交构树青贮比例的提高，拟杆菌门的相对丰度随之提高，以MBP 组最高，这是由于杂交构树青贮比例的提高使瘤胃发酵底物中的粗蛋白质含量随之增加，进而诱导拟杆菌门丰度上升， 但当粗饲料全部为杂交构树青贮时（BPS 组），拟杆菌门的相对丰度显著降低，这可能是由于随着构树比例提高，饲料中单宁等抗营养因子浓度持续增加， 抗营养成分过多会抑制拟杆菌门的增殖或活性 （Abdullah 等，2018）。 本研究中，杂交构树青贮替代基础饲粮中的青贮玉米对瘤胃液中厚壁菌门的丰度无显著影响， 说明饲喂杂交构树青贮未改变瘤胃对植物纤维的降解能力，这一结果与日粮中ADF 和NDF 含量随杂交构树青贮比例的增加变化幅度较小相一致。 疣微菌门的一些细菌在动物的胃肠道消化屏障作用、代谢炎症和免疫耐受方面起重要作用（韩伟等，2019； 李美锋等，2017；De Vos 等，2011），其在肠道的定植可减缓脂肪沉积 （Axling 等，2012），此外， 疣微菌门的一些成员还具有多糖水解酶活性（孙佳丽等，2020）。 本研究中疣微菌门的相对丰度位居第三， 与前人多个研究结果不同 （陈凤梅等 ，2020；Dias 等 ，2018；Chaucheyras-Durand 等 ，2014），推测其在提高务川白山羊的免疫力和减少机体脂肪沉积方面有积极影响， 但究其原因是否与饲喂杂交构树青贮有关尚需进一步研究。

从属水平上来看，普雷沃菌属是反刍动物瘤胃中数量最多的一类拟杆菌门普雷沃氏菌科有益微生物菌属，主要参与蛋白质、淀粉及木聚糖和果胶的降解（金鹿等，2021），在碳水化合物的代谢中起关键作用 （孙佳丽等，2020）。 Pitta 等（2014）研究发现，普雷沃菌属的相对丰度与日粮中NDF 水平呈负相关关系。 本试验中， 日粮的NDF 水平随杂交构树青贮比例增加而提高，但普雷沃式菌属的相对丰度呈现先升高后降低的趋势，与前述拟杆菌门相对丰度的变化一致，说明杂交构树青贮主要通过影响普雷沃式菌属的数量改变拟杆菌门的相对丰度，推测普雷沃菌属的相对丰度受NDF 水平和单宁等抗营养因子的共同作用。未分类的毛螺菌科是瘤胃中的一类半纤维降解菌，普宣宣等（2020）研究发现，卡拉库尔羊瘤胃中未分类的毛螺菌科相对丰度随日粮NFC 水平的增高呈先升高后下降的趋势，这与本研究结果不同。本试验中添加杂交构树青贮降低了务川白山羊瘤胃未分类毛螺菌科的相对丰度，可能是由于粉碎后杂交构树较为粗硬的树枝部分在采食时更容易被剩下，使肉羊实际摄入的半纤维素和木质素水平较青贮玉米更低，从而诱导未分类的毛螺菌科数量减少，但本试验中日粮的NFC 水平是否与未分类毛螺菌科相对丰度的变化有关有待进一步研究。

4 结论

高比例杂交构树青贮显著提高了务川白山羊瘤胃微生物的丰富度；在门和属两个水平上，日粮中添加杂交构树青贮导致与蛋白质、 淀粉和非纤维植物多糖降解有关的拟杆菌门和普雷沃菌属有升高趋势， 以替代50%青贮玉米时相对丰度最高， 杂交构树青贮替代100%青贮玉米时则抑制相关菌群的增殖； 添加杂交构树青贮未对纤维降解菌的数量造成不良影响。