基于电融合方法的牛妊娠相关糖蛋白单克隆抗体制备及其应用

尹茉莉 ， 聂元旺 ， 周婉婷 ， 张 爽 ， 刘 磊 ， 冀慧敏 ， 刘方圆 ， 王会岩

(1.吉林医药学院 吉林省抗体工程科技协同创新中心 ， 吉林 吉林 132013 ； 2. 吉林省吉林市园林管理中心 ，吉林 吉林 132013 ； 3. 吉林特研生物技术有限责任公司 ， 吉林 长春 130112)

随着生活水平的提高，人们对奶制品需求量增加，其中96%的奶制品以牛奶为原料。早期妊娠诊断可以降低奶牛的空怀率，缩短产犊周期，增加牧场养殖的经济效益[1]。牛妊娠相关糖蛋白(Bovine pregnancy-associated glycoproteins，bPAG) 基因家族已发现至少有22个不同转录体以及变异体，主要功能是维持妊娠和免疫调节[2-5]。bPAG可在妊娠母牛外周血液中被检测到，从妊娠开始，bPAG浓度缓慢上升，随着妊娠期的持续，其浓度出现波动，但其平均浓度不断上升，分娩时达到最大浓度。血浆中bPAG浓度是早期妊娠诊断和妊娠监测的可靠生物标志物[6]。

目前，早期妊娠诊断方法主要有观察法、孕酮测定法、超声波扫描法和酶联免疫法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)等[2]。由于ELISA具有快速、灵敏、简便等优点，并且能准确地检测奶牛血液中bPAG浓度及相对浓度的变化而被推广应用。目前，商品化的bPAG-ELISA检测试剂盒主要由美国爱德士和百奥特英公司生产，但因应用进口试剂盒检测的成本过高，许多养殖企业并未使用。国内该种类检测试剂盒尚处于研究阶段，无商品化的报道[7-9]。为此，建立本国自主品牌的bPAG-ELISA检测试剂盒是迫切需要解决的问题。

由于国内外市场上没有售卖可配对的bPAG单克隆抗体，本试验旨在通过电融合方法制备能识别天然bPAG的单克隆抗体，确定最佳配对抗体，以建立双抗夹心ELISA方法，为研发bPAG检测试剂盒提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 奶牛胎盘子叶从吉林市春光乳业有限责任公司采集，经分离纯化获得bPAG天然抗原，纯度达95%，-80 ℃冰箱保存；HRP标记山羊抗小鼠 IgG、鼠类mAb抗体亚类鉴定试剂盒，均购自美国默克公司；蛋白A(Protein A)亲和层析柱，购自苏州纳微科技股份有限公司；牛早孕检测试剂盒，购自北京爱德士元亨生物科技有限公司。

1.2 主要仪器 超净工作台(型号为SW-CJ-2F)，购自安泰空气技术有限公司；CO2培养箱(型号为MCO-18AIC)，购自日本松下健康医疗器械株式会社；细胞计数仪(型号为IC1000)，购自上海乐纯生物技术有限公司。

1.3 实验动物及细胞 雌性BALB/c小鼠(6～8周龄)，购自上海斯拉克实验动物有限公司，实验动物使用许可证号：SYXK(吉)2017—0002；Sp2/0细胞由吉林医药学院吉林省抗体工程科技协同创新中心保存。

1.4 血样采集 采集64头人工授精后28～45 d的奶牛血液样品，分离血清后使用牛早孕检测试剂盒进行检测。在采血当天用 B 超仪对采样奶牛进行妊娠检查，在人工授精后第48天用B超进行复检。

1.5 试验方法

1.5.1 免疫动物 在首次免疫中，用等剂量完全弗氏佐剂乳化的50 μg bPAG腹腔注射免疫雌性BALB/c小鼠。之后每14天使用不完全弗氏佐剂乳化的bPAG免疫1次。第3次免疫后，取小鼠尾血测定血清抗体效价，当效价达到要求时，再加强免疫1次。

1.5.2 细胞电融合及杂交瘤细胞筛选 分离免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按3∶1的比例混合，经链霉蛋白酶E(Pronase E)激活后，在LF498-3铂电极融合室进行电融合。融合细胞密度由电融合缓冲液调整为2×107个/mL。电融合参数设置为0.8 MHz交流电压50 V 20 s，直流脉冲电压450 V 2次0.5 s，融合后50 V 0.8 MHz 7 s。将经过电融合的细胞悬液从融合室移至已预热含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在铺有分离的小鼠腹腔原代细胞作为滋养细胞的96孔板中培养。24 h后每孔需补充HAT选择培养基。融合7～9 d后用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞。使用包被液稀释纯化的 bPAG天然抗原至浓度为2 μg/mL 后，加入聚苯乙烯板。杂交瘤细胞培养上清进行1∶10、1∶200、1∶800稀释作为一抗。HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG(1∶5 000)作为二抗，TMB 底物显色，检测OD450 nm值≥1判定为阳性。记录阳性杂交瘤细胞的集落总数，按公式(1)计算杂交瘤细胞融合效率。

杂交瘤细胞融合效率/%=(杂交瘤集落总数÷脾脏细胞数)×100%

(1)

1.5.3 bPAG单克隆抗体的制备及鉴定 将1×106个/mL阳性杂交瘤细胞接种已提前注射石蜡油的BALB/c小鼠，7～15 d后抽取腹水。用Protein A亲和层析柱纯化腹水，SDS-PAGE分析抗体纯度。Western blot检测抗bPAG单克隆抗体的特异性。使用半干法(100 mA，30 min)将从牛胎盘组织中粗提的天然bPAG蛋白转移至 PVDF 膜上，加入纯化的抗bPAG 单克隆抗体(1∶2 000)；二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)；ECL显色，观察结果。用鼠类mAb抗体亚类鉴定试剂盒分析抗体的免疫球蛋白亚类。间接ELISA方法测定单克隆抗体效价。参照参考文献[10]的ELISA方法检测单抗与bPAG的亲和力。

1.5.4 酶标bPAG单克隆抗体效价检测 制备的bPAG单抗用高碘酸钠法标记HRP后作为检测抗体[11]。bPAG抗原包被浓度为2 μg/mL，将酶标单抗从1∶200起进行2倍倍比稀释，共设12个稀释度，每个稀释度重复3次，同时设免疫小鼠血清作为阳性对照，封闭液作为空白对照。OD450 nm值≥1.0时，作为最佳抗体稀释度。

1.5.5 双抗夹心ELISA方法的初步建立 将获得的单克隆抗体作为捕获抗体包板，浓度为5 μg/mL，4 ℃过夜。将抗原bPAG稀释成浓度为10 μg/mL，同时设免疫小鼠血清作为阳性对照，封闭液作为空白对照。加入HRP标记的单克隆抗体进行两两配对，确定可用于建立夹心ELISA方法的配对抗体。当OD450 nm值≥1时，作为强阳性(P)，OD450 nm值≤0.15时，作为阴性(N)。抗体的工作浓度采用棋盘滴定法[12]确定，根据OD450 nm值≥1，且P/N>2.1时，判定为最佳工作浓度。初步建立夹心ELISA检测方法。

符合率/%=(真妊娠数+真未妊娠数)÷检测总数×100%

(2)

2 结果

2.1 细胞电融合及杂交瘤细胞筛选 使用本实验室优化的电融合技术进行细胞融合，经计算杂交瘤细胞融合效率为0.34%。经间接ELISA筛选，获得43个识别bPAG 抗原IgGs的杂交瘤克隆(图1A)。将杂交瘤细胞培养上清进行1∶10、1∶200、1∶800稀释，间接ELISA筛选获得5株强阳性单克隆抗体，分别命名为2D7、3G1、5G1、4A10和10H2(图1B)。

图1 阳性杂交瘤细胞株的筛查Fig.1 Screening of positive hybridoma cell linesA：阳性杂交瘤细胞株； B：5株强阳性杂交瘤细胞A：Positive hybridoma cell lines； B：Five strong positive hybridoma cell lines

2.2 bPAG单克隆抗体的制备及鉴定 腹水纯化后，经SDS-PAGE鉴定，在55 kDa和25 kDa附近有2条清晰的条带，分别为抗体的重链和轻链，污染蛋白很少(图2)。Western blot结果如图3所示，纯化所得的5株单克隆抗体均能特异性识别bPAG天然蛋白，在35 kDa处均出现目的条带，这与报道从妊娠奶牛、山羊、绵羊胎盘组织中分离纯化多种PAG亚型分子量为35～76 kDa相符[13]。由表1可知，2D7、5G1和10H2亚类均为IgG1，3G1亚类为IgG2b，4A10亚类为IgG2a。间接ELISA法检测5株单克隆抗体效价，3G1和5G1效价为1∶256 000，2D7、10H2和4A10效价为1∶128 000(表1)。2D7、3G1、5G1、4A10和10H2抗体亲和力分别为1.63×107L/mol、3.75×107L/mol、1.74×107L/mol、5.83×106L/mol和2.76×107L/mol(表1)。

表1 5株bPAG单克隆抗体的鉴定Table 1 Assessment of five monoclonal antibodies against bPAG

图2 SDS-PAGE分析5株纯化后的单克隆抗体Fig.2 SDS-PAGE analysis of five purified monoclonal antibodiesM：Protein Marker； 1：2D7； 2：3G1； 3：5G1； 4：4A10； 5：10H2

图3 Western blot 检测单克隆抗体特异性Fig.3 Western blot analysis of specificity of monoclonal antibodies 1：2D7； 2：3G1； 3：5G1； 4：4A10； 5：10H2

2.3 酶标bPAG单克隆抗体效价检测 如图4所示，酶标抗体HRP-2D7、HRP-3G1、HRP-5G1、HRP-4A10和HRP-10H2最佳稀释倍数分别为1∶6 400、1∶12 800、1∶6 400、1∶6 400和1∶12 800。

图4 酶标抗体效价检测Fig.4 Determination of enzyme-labeled antibody titers

2.4 双抗夹心ELISA检测方法的初步建立 如表2所示，以10H2作为捕获抗体与HRP标记的5G1配对成功，可用于建立双抗夹心ELISA方法。包被不同浓度的单克隆抗体10H2与不同稀释倍数的HRP-5G1单抗作棋盘滴定法确定抗体的工作浓度。结果如表3所示，单抗10H2包被浓度为2 μg/mL，HRP-5G1单抗最佳稀释倍数为1∶4 000。

表2 单克隆抗体配对结果Table 2 Results of monoclonal antibody coupling

表3 单克隆抗体适宜浓度Table 3 Suitable concentration of monoclonal antibody

2.5 双抗夹心ELISA方法检测血清样品 根据爱德士牛早孕检测试剂盒判断结果制定双抗夹心ELISA方法的阴性、阳性检测结果的判断标准，检测OD450 nm值>0.7判为阳性，检测OD450 nm值<0.5判为阴性，结果见图5。以B超检测结果作为真实妊娠判定标准，发现爱德士牛早孕检测试剂盒与B超检测结果比较符合率为98.4%(63/64)。双抗夹心ELISA方法测定的妊娠结果中有2个假阳性结果，2个假阴性结果，与B超检测结果比较符合率为93.8%(60/64)，与爱德士牛早孕检测试剂盒比较符合率为95.2%(60/63)，结果见表4。

图5 双抗夹心ELISA检测牛血清结果Fig.5 Results of cow serum samples detected by double antibody-sandwich ELISA

表4 3种检测方法的比较Table 4 Comparison of three detection method

3 讨论

PAG属于无活性天冬氨酸蛋白酶家族，与胃蛋白酶有50%以上的相同氨基酸序列，其中bPAG种类繁多，其家族成员同源性较高，在牛妊娠期，每种bPAG的浓度及功能尚不明确[14-15]。从妊娠后的多种母畜胎盘胎儿子叶中可以分离提取PAG天然蛋白，PAG作为多种动物的妊娠诊断标志物，研发血清中PAG的检测方法一直备受关注[16]。本试验为了获得能够识别天然bPAG的单克隆抗体，从妊娠母牛胎盘子叶中分离提纯bPAG，免疫小鼠，取其脾细胞与SP2/0细胞通过电融合法进行细胞融合。

单克隆抗体制备的经典方法是PEG诱导的细胞融合技术，但其融合效率低，对细胞有毒害作用，很难获得令人满意的抗体[17]。电融合技术是一种高效、可复制、无毒的细胞融合技术，不仅提高了融合细胞的数量，而且提高了杂交瘤的生长速度，更容易获得具有高度亲和力的单克隆抗体[18]。交变电场强度、融合仪器型号、细胞类型及比例、脉冲强度等融合参数会直接影响细胞融合率。在进行电融合时，需要摸索各项条件，选择最适试验参数。本试验选择交流电场强度为50 V，直流脉冲强度为450 V，脾脏细胞和SP2/0骨髓瘤细胞以3∶1的比例进行电融合，细胞融合率达到0.34%，杂交瘤细胞状态饱满，呈对数生长。间接ELISA筛选到5株强阳性抗bPAG单克隆抗体。为验证单抗与天然形式bPAG结合的特性，本试验使用含磷酸酶和蛋白酶抑制剂的裂解液裂解牛子叶组织，获得的粗提蛋白进行单克隆抗体特异性鉴定。

针对bPAG开发的爱德士牛早孕ELISA检测试剂盒诊断准确率可达97.8%[19]，从养殖场取回的阴性、阳性血清样本经过爱德士牛早孕检测试剂盒判断后，再由本实验室建立的双抗夹心ELISA检测方法验证，比较检测结果的符合率。在64个样本检测过程中有4个样本与B超检测真实妊娠结果不符合，爱德士牛早孕检测试剂盒与B超检测结果符合率为98.4%，双抗夹心ELISA方法与B超检测结果符合率为93.8%。为获得更高度一致性的检测结果，我们需要继续优化检测方法，包括抗体的包被浓度、酶标二抗的工作浓度、抗原抗体反应时间、显示时间等。目前，检查母羊妊娠第18天血清中PAG和孕酮浓度已有报道，还未见测定妊娠母牛PAG浓度的报道[20]。本课题组将在后续试验中进行大量样本验证，以优化技术参数，建立定性、定量的bPAG检测方法。