云南省独龙牛贾第虫分子流行病学调查

庄尔俊 ， 岳凤娇 ， 赵俊杰 ， 李海龙,2

(1.大理大学基础医学院 ， 云南 大理 671000 ； 2.云南省滇西抗病原植物资源筛选研究重点实验室 ， 云南 大理 671000)

蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialamblia,G.lamblia)简称贾第虫，是一种人兽共患、肠道内寄生的单细胞原虫，呈世界性分布[1]。贾第虫感染宿主种类多，除人外，还包括绝大多数的哺乳动物[2]。贾第虫病的传播途径主要是粪—口传播，由粪便污染的水源、食物或直接接触粪便引起，感染后可出现持续性腹泻、吸收不良、稀便、胀气、疲劳等症状[3]。近年来，国内外对于人和动物感染贾第虫的流行病学调查和基因型鉴定日益增多，在我国广东、上海、河南、江西、宁夏等地均已有报道[4-8]。

哺乳动物中牛是贾第虫常见的宿主之一，独龙牛(Bosfrontalis,B.frontalis)是云南省怒江州的珍稀牛种，主要分布于云南省怒江州。贾第虫作为一种人兽共患寄生虫，其感染不仅可能对独龙牛的健康带来影响，引起疾病，还可能威胁当地居民的健康和公共卫生。本试验以怒江州独龙牛为调查对象，进行贾第虫的分子流行病学调查，旨在为当地贾第虫的防控和研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 样本采集 于2017年9月—2018年9月，在云南省怒江州5个采样点，分别为怒江流域的古泉村、亚左洛村、鸠门当村、茨开镇和独龙江流域的独龙江乡，按4个季节(春、夏、秋、冬)采集新鲜独龙牛粪便共987份，其中怒江流域813份，独龙江流域174份，-20 ℃保存。贾第虫阳性DNA样本由本实验室保存。

1.2 主要试剂 粪便DNA提取试剂盒，购自美国OMEGA公司；MgCl2、dNTPs Mixture、10×PCR Buffer、TaqDNA聚合酶、DNA Marker DL2 000、6×DNA Loading Buffer，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA的提取与引物设计 根据粪便DNA提取试剂盒说明书步骤提取独龙牛粪便样本DNA，置-20 ℃冻存备用。目的基因根据贾第虫β-贾第素(β-giardin,BG)基因，参考Bartley等[9]发表的研究报道设计2对引物，第1对引物：上游引物F1：5′-AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGTGC-3′，下游引物R1：5′-GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC-3′；第2对引物：上游引物F2：5′-GAACGAACGAGATCGAGGTCCG-3′，下游引物R2：5′-CTCGACGAGCTTCGTGTT-3′。

1.3.2 巢式PCR扩增 采用巢式PCR，预扩增产物为511 bp。PCR扩增体系(总体积25 μL)：10×PCR Buffer 2.50 μL，MgCl21.50 μL，dNTP Mixrure 2.00 μL，Ex-Taq0.25 μL，引物F1/R1、F2/R2均为0.25 μL，模板DNA 2.50 μL，加ddH2O补至25.00 μL。第1轮扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共34个循环；72 ℃再延伸10 min；第2轮扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共34个循环；72 ℃再延伸10 min。取5 μL PCR产物与1 μL的6×DNA Loading Buffer混合后，进行2%琼脂糖凝胶电泳，电压120 V，电泳时间约30 min。

1.3.3 测序结果分析 将PCR扩增结果中与目的条带大小相近的产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。用Clustal X 1.83和BLAST对测序结果进行序列比对，所获得的样本序列在GenBank 上与贾第虫参考序列进行同源性比对，然后用MEGA-X计算序列之间的遗传距离，采用邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统进化树。

1.3.4 统计学分析 使用SPSS 19.0软件对试验数据进行统计分析，采用卡方检验分析不同采样点、不同流域和不同季节中独龙牛的贾第虫感染率的差异。当P<0.05时，统计学差异显著。

2 结果

2.1 巢式PCR扩增 根据贾第虫BG基因位点进行巢式PCR扩增，987份独龙牛粪便样品中，共有102份扩增出大小约为511 bp的条带(图1)，总阳性率为10.33%。

图1 贾第虫BG基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of BG gene from G.lambliaM:DL2 000 DNA Marker； 1：阳性对照； 2：阴性对照； 3～17:部分阳性样品M:DL2 000 DNA Marker; 1:Positive control; 2:Negative control; 3-17:Some positive samples

2.2 测序结果分析及基因型鉴定 对获得的贾第虫102份阳性样品的测序结果进行比对分析，共检测出集聚体 A、B和E三种基因型，包括A集聚体亚型集聚体AII，均为人兽共患基因型；人兽共患基因型集聚体A的数量最多，共有93份(91.18%,93/102)。5个采样点中均有集聚体A感染，集聚体B和E仅在鸠门当村有感染(表1)。基于BG基因进行系统发育分析并构建进化树，序列分析结果显示，共有8条不同的DNA序列，上传至GenBank，登录号分别为MZ682631、MZ701835、MZ720824～MZ720829)(图2)。贾第虫集聚体A基因型与GenBank：EU769205.2相比，序列同源性为96.93%～99.70%；贾第虫集聚体E基因型与GenBank：KY658184.1相比，序列同源性为100%；贾第虫集聚体B基因型与GenBank：MT713324.1相比，序列同源性为99.16%。

表1 云南省独龙牛贾第虫基因型分布Table 1 Genotypes of G.lamblia in B.frontalis in Yunnan Province

图2 贾第虫BG基因系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of G.lamblia based on BG gene sequence▲:本试验鉴定的集聚体A基因型； ■：本试验鉴定的集聚体B基因型； ●：本试验鉴定的集聚体E基因型▲：Assemblage A genotypes identified in this study； ■：Assemblage B genotype identified in this study； ●：Assemblage E genotype identified in this study

2.3 独龙牛贾第虫感染情况统计 987份独龙牛粪便样品中贾第虫阳性样本共102份，总感染率为10.33%，5个地点中，怒江流域的古泉村、亚左洛村、鸠门当村、茨开镇感染率分别为10.19%(21/206)、13.90%(26/187)、11.98%(23/192)、8.33%(19/228)，独龙江流域的独龙江乡感染率为7.47%(13/174)，亚左洛村与独龙江乡之间贾第虫感染率差异显著(P<0.05)；独龙江流域和怒江流域感染率分别为7.47%(13/174)和10.95%(89/813)，差异不显著(P>0.05)(表2)。春、夏、秋、冬4个季节中，贾第虫感染率分别为12.05%(30/249)、10.55%(25/237)、8.68%(23/265)、10.17%(24/236)，经统计学分析比较，差异不显著(P>0.05)(表3)。

表2 不同采样点贾第虫的感染情况Table 2 Infection of G. lamblia in different sampling sites

表3 不同季节贾第虫的感染情况Table 3 Infection of G.lamblia in different seasons

3 讨论

近年来，国外的研究报道显示，独龙牛可感染牛弓首蛔虫、指形长刺线虫、棘球绦虫、弓形虫[10-12]，国内的独龙牛感染的寄生虫有环孢子虫和毕氏肠微孢子虫[13-14]。人和动物贾第虫的流行病学调查在世界范围内均有报道，但我国云南省独龙牛贾第虫的相关报道较为罕见。本试验通过调查云南省怒江州独龙牛贾第虫的感染情况，发现独龙江和怒江两大流域感染率差异不显著(P>0.05)，亚左洛村感染率最高，独龙江乡感染率最低，可能与当地养殖模式有关。本试验中独龙牛感染阳性率为10.33%，与江西省报道的牛感染率相近(9.2%)[7]；高于甘肃省奶牛感染率(1%)[15]，西藏自治区牛感染率(3.8%)[16]；低于江苏省奶牛感染率(20.6%)[17]，四川省断奶后犊牛感染率(41.2%)[18]，广东省断奶前奶牛感染率(74.2%)[19]。贾第虫感染率的差异可能与地理位置、生态环境、采样数量、品种、检测方法、植被以及自身免疫状况等因素相关。本试验结果显示，四季中独龙牛贾第虫感染率在春季最高，秋季最低，但差异不显著(P>0.05)，四季感染率呈现不同流行趋势，可能是由于独龙牛所处怒江地区为低纬带高海拔，造就了独特的立体气候导致的。

本试验基于贾第虫BG基因，通过测序分析，鉴定出3种基因型，分别为集聚体A、B、E，其中集聚体A有93份(93/102)，5个采样点中均有感染，推测为怒江州独龙牛感染贾第虫的优势基因型，集聚体B(1/102)和集聚体E(8/102)仅在鸠门当村有感染。目前为止，贾第虫具有8种基因型，即集聚体A～H，根据Li等[20]的研究报道，集聚体A、B、E均为人兽共患基因型，集聚体E为我国牛感染贾第虫的优势基因型。

独龙牛是怒江州当地独龙族居民长期驯养的一种半野生畜种，繁育价值高，具有良好的经济前景，但因地处偏远山区，增加了人兽共患寄生虫病的防治工作难度。本试验结果表明，独龙牛感染的贾第虫基因型均为人兽共患基因型，对当地独龙牛产业以及公共卫生构成威胁，建议有关部门定期检查和驱虫，加强对贾第虫的防治以及宣传教育，做好水源卫生管理。