狐狸源停乳链球菌类马亚种的分离鉴定和耐药性分析

张瑞华 ， 高善颂 ， 庞天津 ， 张丹萍 ， 窦心怡 ， 李焕发 ， 丛 杨 ， 韩先杰

(1. 青岛农业大学动物医学院 ， 山东 青岛 266109 ； 2. 青岛中仁动物药品有限公司 ， 山东 青岛 266300)

停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)分为停乳链球菌类马亚种(Streptococcusdysgalactiaesubsp.equisimilis,SDSE)和停乳链球菌停乳亚种(Streptococcusdysgalactiaesubsp.dysgalactiae,SDSD)，为链球菌属的成员之一，是牛和羊乳腺炎的主要病原体。停乳链球菌为革兰阳性球菌，显微镜下成对或链状排列，兰氏分群为C群[1]。停乳链球菌类马亚种于1996年首次被发现，其在血琼脂平板上呈现β溶血[2]。该菌可以通过伤口、皮肤等途径进入血液中造成菌血症或败血症，通常会引起人的化脓性疾病、呼吸道疾病和牛羊的乳腺炎等疾病[3]。

2020年8月，山东省预防兽医学重点实验室接到文登市某规模化狐狸养殖场送检的病死狐狸，本试验对送检的病例进行了细菌分离鉴定、基因测序、动物试验和耐药性分析，为确诊此次疫情及该狐狸养殖场防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源 5只病死狐狸，由山东省文登市某规模化狐狸养殖场提供。

1.2 主要试剂 脑心浸液肉汤、血琼脂平板、革兰染色液等，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；API 20 STREP链球菌属生化鉴定试剂盒，购自生物梅里埃法国股份有限公司；药敏试纸，购自青岛科盛源科技发展有限公司；Bacteria DNA lsolation Mini Kit DNA提取试剂盒、PCR反应试剂、Gel DNA Extraction Mini Kit胶回收试剂盒等，均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.3 实验动物 20～24 g健康昆明系小鼠，购自青岛大任富城畜牧有限公司。

1.4 细菌分离、培养和纯化 无菌条件下取病死狐狸的脾脏划线接种到血琼脂平板上，于37 ℃恒温培养箱培养24～36 h；挑取大小、形态和颜色基本一致的菌落再次接种至血琼脂平板，置于37 ℃恒温培养箱培养24～36 h，进行细菌纯化；挑取单菌落接种至脑心浸液肉汤中增殖培养；挑取单菌落进行革兰染色，显微镜下观察形态特征。

1.5 生化鉴定 按照API 20 STREP链球菌属生化鉴定试剂盒说明书对分离菌株进行生化鉴定。

1.6 PCR鉴定和序列分析 根据链球菌16S rRNA 基因，使用Primier 5.0软件设计1对链球菌通用引物(F:5′-GCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCG-3′；R:5′-GGCTTTAAGAGATTAGCTTGCC-3′；扩增片段大小为891 bp)，并交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。增殖培养的分离菌株使用Bacteria DNA lsolation Mini Kit 试剂盒提取DNA。PCR扩增体系(25.0 μL)：2×Master Mix 12.5 μL，上游引物(F)1.0 μL，下游引物(R)1.0 μL，DNA模板1.5 μL，无菌水9.0 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，33个循环; 72 ℃终延伸7 min，4 ℃保存结束反应。扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用Gel DNA Extraction Mini Kit胶回收试剂盒回收产物，并交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因测序。测序结果使用NCBI网站的BLAST工具进行比对，并利用MEGA 6软件绘制遗传进化树。

1.7 药敏试验 按照K-B药敏纸片琼脂扩散法进行操作，吸取100 μL含分离菌株的脑心浸液肉汤至含5%血清的TSA平板上，使用一次性涂布器将其均匀涂抹开，随后将药敏纸片放置到平板上，置于37 ℃恒温培养箱中培养24～36 h，药敏试验按照美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)标准判定结果[4]。

1.8 动物试验 设置6个试验组和1个对照组，每组随机选取10只小鼠。分别向试验组小鼠注射1.5×108、3×108、6×108、1.2×109、2.4×109CFU和4.8×109CFU菌液，对照组小鼠注射无菌PBS。连续观察7 d，记录小鼠发病和死亡情况，计算半数致死量(Median lethal dose,LD50)。剖检死亡小鼠，观察其病变情况，无菌采集病变组织，分离细菌，进行病原菌鉴定。

2 结果

2.1 分离菌的培养特性和形态特征 分离菌在血琼脂平板上生长缓慢，培养24 h可见针尖大小菌落，培养48 h后可见直径0.8～1.2 mm、乳白色、圆形、表面湿润的菌落。菌落周围呈现β型溶血。分离菌革兰染色为阳性球菌，成对或呈链状排列(图1)。

图1 显微镜下分离菌形态 (革兰染色，1 000×)Fig.1 Microscopic morphology of isolated strains (Gram staining,1 000×)

2.2 生化鉴定 3株分离菌使用API 20 STREP链球菌属生化鉴定试剂盒得到的鉴定编码均为4463415，经系统鉴定，分离菌为停乳链球菌类马亚种的可信度达99.6%(%ID=99.6)，T值=0.91，鉴定结果见表1，结果良好，初步将其判定为停乳链球菌类马亚种。

表1 生化鉴定结果Table 1 Results of biochemical identification

2.3 PCR鉴定 3株分离菌经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，出现大小约为891 bp的条带，见图2，与预期大小相符，初步鉴定为链球菌，将其分别命名为SD-TR03、SD-TR04和SD-TR05。

图2 分离菌16S rRNA基因的PCR鉴定Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA gene from isolated strainsM：DNA标准DL2 000； 1：SD-TR03； 2：SD-TR04； 3：SD-TR05； 4：阴性对照M：DL2 000 DNA Marker； 1：SD-TR03； 2：SD-TR04； 3：SD-TR05； 4：Negative control

2.4 序列分析 使用NCBI网站上的BLAST工具将3株分离菌测序序列与基因库中的序列进行同源性比对，结果显示，分离菌株与停乳链球菌类马亚种(GenBank登录号：CP053074.1、CP051624.1和CP051623.1)序列同源性均高达100%，可以确定此次试验从该养殖场不同病死狐狸中分离到的3株优势菌均为停乳链球菌类马亚种。根据序列进化树结果分析可知，分离株SD-TR03、SD-TR04、SD-TR05与日本分离株Kdys0611、TPCH-A88以及沙特分离株SCDR-SD1在同一分支，亲缘关系较近(图3)。

图3 分离菌基于16S rRNA基因序列的遗传进化分析Fig.3 Phylogenetic tree of isolated strains based on 16S rRNA gene sequence▲：本试验分离株▲：Strains isolated in this study

2.5 药敏试验 本试验分离株对头孢曲松、左氧氟沙星、头孢吡肟、头孢噻肟、氨苄西林、氯霉素、头孢唑林、阿莫西林、苯唑西林、氟苯尼考、利福平敏感，对卡那霉素和新霉素中敏，对亚胺培南、头孢呋辛、诺氟沙星、庆大霉素、四环素、环丙沙星、阿奇霉素、克林霉素、红霉素耐药(表2)。

表2 分离菌药物敏感试验Table 2 Drug sensitivity test of isolated strains

2.6 动物试验 接种菌液的小鼠呈现精神萎靡、扎堆聚集、活动减少等症状，接种大剂量菌液(≥2.4×109CFU)的小鼠于16 h内全部死亡(表3)。剖检死亡小鼠，可见其脾脏肿大，颜色暗淡，肺脏有针尖状出血，肾脏肿大。无菌采集死亡小鼠腹腔液接种血平板，可见形状单一，呈现β溶血的菌落。革兰染色镜检显示为成对或呈链状排列的革兰阳性球菌。试验数据使用SPSS Statistics 25.0软件处理后得出不同死亡概率对应的接种菌液剂量以及接种菌液剂量的95%置信区间(CI)，概率为0.500时的菌液剂量即为半数致死量(LD50)，经查询输出数据可知，分离菌的LD50为5.818×108CFU，95%CI为3.695×108～8.865×108CFU(表4)。

表3 各组小鼠注射分离菌剂量与死亡数量统计Table 3 Statistics of the injected doses of isolated strains and the number of deaths in mice of each group

表4 不同死亡概率所对应的接种菌液剂量以及95%置信区间Table 4 Inoculant amounts and 95%CI for different mortality probability

3 讨论

本试验从山东省文登市某规模化狐狸养殖场提供的不同病例中分离到了3株优势菌，通过细菌分离纯化、革兰染色、生化鉴定、基因测序分析等，确定本次引起该狐狸养殖场狐狸死亡的病原菌为停乳链球菌类马亚种。将该菌接种小鼠会使小鼠在短时间内死亡，具有很强的致病性。通过药敏试验发现，在22种抗菌药中该菌对11种抗菌药敏感，2种抗菌药中敏，9种抗菌药耐药，因此在发生疑似停乳链球菌类马亚种感染时要及时送检，并根据药敏试验指导用药，避免滥用抗菌药。

停乳链球菌通常会引起牛、羊等动物的乳腺炎症[1]，而且能够引起人类的菌血症和化脓性疾病，特别是老年人和抵抗力低下的人群[5]。2020年5月22日在天津发生一起由停乳链球菌类马亚种感染导致的聚集性发热，发病者多为青壮年，主要以呼吸道症状为主且症状相对较轻[6]。因此该菌对公共卫生安全具有一定的危害，需要引起足够的重视。何永强等[7]在2009年对进境狐狸的检测中曾发现具有致病性的停乳链球菌，因此应加强对入境动物和乳制品的检疫。目前，国内对于停乳链球菌的研究主要集中在猪和貉等动物上，龙剑等[8]于2019年7月在湖南某猪场的仔猪病料中分离出具有较强致病性的猪源停乳链球菌类马亚种；2020年8月盖玉强等[9]在山东省文登市某貉养殖场发病幼貉中分离到1株貉源停乳链球菌类马亚种。查阅国外文献罕见狐狸源停乳链球菌类马亚种的相关报道。本试验结果为狐狸源停乳链球菌类马亚种的防控提供了依据。