藏羊源枯草芽孢杆菌的分离鉴定与生物学特性

徐淑琴 ， 马祥兆 ， 陈晓慧 ， 贺 曦 ， 贺晓龙 ， 冶贵生

(1.青海大学农牧学院 ， 青海 西宁 810016 ; 2.青海省动物疾病病原诊断与绿色防控技术研究重点实验室 , 青海 西宁 810016)

藏羊是青藏高原的特色畜种之一，对恶劣环境具有较强的适应性，采食粗饲草类后主要通过瘤胃微生物的复杂且多方面的协调方式进行发酵和降解[1]。而纤维降解菌作为瘤胃微生物中的优势菌群，主要分泌与纤维降解相关的酶来发挥降解纤维素的作用，进一步促进对饲草的利用率[2]。其中，芽孢杆菌中就可产生内切纤维素酶、外切纤维素酶、葡萄糖苷酶等纤维素活性酶，这些酶具有稳定性好、抗逆性强、产酶活性高等优势[3]。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)早在1989年被美国食品与药物管理局批准使用，随后在1999年我国农业部也批准使用该菌，其是目前公认的安全菌株[4]。枯草芽孢杆菌具有代谢产物种类多、抑菌活性强、抑菌谱广、能激活免疫、促进生长等功能特性[5]。枯草芽孢杆菌通过对营养和空间位点的竞争、分泌抗菌物质及溶菌作用在生物防治方面发挥着重要的作用[6]，作为益生菌还具有改善肠道环境、产生多种消化酶和营养物质、提高动物免疫力等优势，因此在畜牧养殖业中被广泛使用[7]。研究表明，来源于动物胃肠道的益生菌能够更好地发挥菌株在消化道内的定植及胃肠道益生功效[8]。因此，本试验利用选择性培养基从藏羊瘤胃内容物中分离筛选出可降解纤维素的芽孢菌株，并对其生物学特性进行研究，以期为藏羊源益生菌的开发及其在畜牧生产上的应用提供候选菌株。

1 材料与方法

1.1 样品及菌株来源 藏羊瘤胃内容物样品采自青海省海北藏族自治州某养殖场。指示菌株：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌、产气荚膜梭菌，均为本实验室自行分离保存菌株。

1.2 主要试剂 纤维素刚果红培养基、胰蛋白胨大豆肉汤、LB肉汤、MH琼脂、四联式牛津杯、革兰染色液试剂盒、细菌微量生化鉴定管，均购自青岛海博生物技术有限公司；药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 降解纤维素芽孢杆菌的分离筛选 取新鲜瘤胃内容物于胰蛋白胨大豆肉汤过夜增菌培养。挑取菌液于纤维素刚果红培养基上划线分离培养；于37 ℃培养24 h，观察菌落颜色，选取红色菌落进行革兰染色镜检。

1.3.2 分离菌株生化鉴定 根据分离菌株的菌落和菌体形态，参照参考文献[9]进行糖醇类发酵试验、氧化酶试验、触酶试验、甲基红(MR)试验、V-P试验、吲哚试验等生化试验。

1.3.3 分离菌株分子生物学鉴定 用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌株全基因组DNA，采用细菌16S rDNA通用引物通过PCR方法扩增分离菌株16S rDNA[10]。30 μL PCR反应体系：模板1 μL，2×PCR Mix 15 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 12 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸5 min，最后4 ℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，对阳性产物测序并将序列通过BLAST比对，利用MEGA 7.0软件，采用Neighbor-Joining法构建系统进化树。

1.3.4 分离菌株抑菌试验 将活化好的指示菌稀释成浓度为108CFU/mL的菌悬液，吸取100 μL均匀涂布于LB琼脂平板上。将培养24 h的分离菌株12 000 r/ min离心10 min，取上清200 μL注入牛津杯内，于4 ℃放置12 h后移至37 ℃培养箱静置培养12 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.3.5 分离菌株生长曲线的测定 调整活化好的菌液细菌浓度为108CFU/mL，按1%的接种量接种，37 ℃、180 r/min摇床振荡孵育，每隔2 h取样1次，测定0～24 h菌液OD600 nm值，以OD600 nm值为纵坐标，时间为横坐标，绘制分离菌株生长曲线。

1.3.6 分离菌株药敏试验 采用K-B纸片扩散法检测分离菌株对30种常用抗菌药的敏感性[11]。

1.3.7 分离菌株耐高温试验 分离菌株按1%接种量接种于LB液体培养基中，处理组分别在40、60 ℃和80 ℃水浴30 min，空白对照组为37 ℃，平板计数后按公式(1)计算菌株存活率。

菌株存活率/%=(处理组活菌数÷空白对照组活菌数)×100%

(1)

1.3.8 分离菌株耐酸试验 处理组取分离菌株按1%接种量接种到pH调整为3.0、4.0、7.0、8.0的LB液体培养基中，空白对照组为原液，180 r/min 37 ℃恒温培养，分别在4 h和24 h进行平板计数，按照公式(1)计算菌株存活率。

2 结果

2.1 降解纤维素芽孢杆菌的分离筛选 菌株在纤维素刚果红培养基上菌落呈粉红色，纹状皱褶，表面不平整，边缘不整齐分离(图1A)；镜检结果显示，分离菌株革兰染色呈蓝紫色革兰阳性菌，直杆状，芽孢近端生，椭圆，孢囊不膨大(图1B)，将其命名为BS1-ql。

图1 分离菌株的形态特性Fig.1 Morphology characteristics of the isolated strainA：菌落形态； B：菌体形态 (100×)A:Colony morphology; B:Mycelial morphology (100 ×)

2.2 分离菌株生化鉴定 分离菌株BS1-ql能发酵甘露醇、山梨醇、水杨苷、木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖，不能发酵棉子糖、麦芽糖、松三糖等，不形成吲哚，能水解淀粉、还原硝酸盐、利用西蒙氏枸橼酸盐，不能利用丙酸盐，在7%氯化钠、pH 5.7生长管中可生长，氧化酶试验、触酶试验、V-P试验呈阳性，甲基红反应为阴性(表1)，均符合芽孢杆菌的生化鉴定特征。

表1 分离菌株的生化鉴定Table 1 Biochemical identification of the isolated strain

2.3 分离菌株分子生物学鉴定 通过PCR从细菌基因组DNA中扩增出目的片段，经过电泳分析PCR产物的大小与预期一致(图2)。分离株BS1-ql序列与参考芽孢杆菌16S rDNA序列相似度达96%以上(图3)。分离株BS1-ql与枯草芽孢杆菌同源性为100%，并与之聚为一簇(图4)。结合生化和分子生物学鉴定结果，综合判定分离菌株为枯草芽孢杆菌。

图2 分离菌株的PCR扩增Fig.2 PCR amplification of the isolated strainM：DL2 000 DNA Marker； 1：分离菌株； N：阴性对照M:DL2 000 DNA Marker; 1:Isolated strain; N:Negative control

图3 分离菌株16S rDNA同源性比对Fig.3 16S rDNA homology comparison of the isolated strain

图4 分离菌株系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of the isolated strain▲:本试验分离菌株▲：Strain isolated in this study

2.4 分离菌株抑菌试验 分离菌株BS1-ql上清液对沙门菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、产气荚膜梭菌分离菌株的抑菌圈直径分别为8.72、14.50、6.00 mm和27.72 mm，表明枯草芽孢杆菌分离菌株分泌的抗菌物质对这4种致病菌有不同程度的抑制能力，其中对金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌的抑制作用最为明显。

2.5 分离菌株生长曲线的测定 由图5可知，分离菌株BS1-ql在0～2 h生长速度较慢，处于延滞期；2 h后生长迅速，OD600 nm值迅速升高进入对数生长期；6 h后生长变缓，逐步进入稳定期；20 h后分离菌株的生长量下降，进入衰亡期。

2.6 分离菌株药敏试验 如2表所示，分离菌株BS1-ql对四环素和多黏菌素B表现为中度敏感，对青霉素、头孢曲松、卡那霉素、多西环素、呋喃唑酮、新霉素等28种抗菌药物均表现为敏感。

2.7 分离菌株耐高温试验 如图6所示，分离菌株BS1-ql在40 ℃水浴30 min后存活率达90.32%，随着水浴温度的升高，菌株存活率呈直线下降趋势，但仍能存活；菌株在60 ℃、80 ℃水浴培养24 h的存活率与水浴30 min的存活率相比，明显增大，分别为38.75%和58.75%，说明分离菌株BS1-ql具备一定的耐高温能力。

图6 分离菌株对不同温度的耐受性Fig.6 Tolerance of the isolated strain to different temperature

2.8 分离菌株耐酸试验 分离菌株在pH 2.0的LB液体培养基中培养4 h和24 h后,用平板涂布法检测不到存活菌株；在pH 7.0、pH 8.0的LB液体培养基中培养4 h的存活率分别为1.39%和1.11%，培养24 h后菌株存活率有所升高，分别为7.50%和3.70%。说明培养环境的酸碱性对分离菌株BS1-ql的生长有直接影响，pH越小存活率越低，对碱性环境有一定的抵抗力。

图7 分离株对不同酸度的抗逆性Fig.7 Tolerance of the isolated strain to different acidity

3 讨论

青藏高原作为特殊的生态系统，孕育了性能优良的藏羊品种[12]，藏羊在进化的过程中，瘤胃内已经形成了独特的微生物。瘤胃微生物主要由细菌、原虫、厌氧真菌和少量的噬菌体组成，其中细菌的种类和数量最为丰富，根据功能差异可分为纤维降解菌、蛋白质降解菌和脂肪降解菌等，这些菌群在瘤胃中发挥不同的功能[13]。其中纤维降解菌主要是通过产生各类酶与纤维素相互作用，进而转化成机体可分解吸收的分子。本试验选用纤维素刚果红培养基为选择性培养基对藏羊瘤胃微生物进行筛选，得到纤维素降解菌，结合生化试验和16S rDNA PCR扩增进行鉴定。此方法通过表型特征与基因鉴定相结合，操作简单便捷，能快速有效地筛选出目标细菌，且能够准确鉴定分离菌株的亲缘关系和分类地位。

枯草芽孢杆菌不仅可以产生多种酶提高以粗饲草为主的反刍动物的饲料消化率[14]，还可以通过分泌抑菌物质、产生挥发性物质、竞争作用等对动植物致病菌产生明显的抑制作用[15]。辛国芹等[16]、Lu等[17]研究表明，枯草芽孢杆菌发酵液对大肠埃希菌、沙门菌、肠球菌和金黄色葡萄球菌有较好的抑菌效果。本试验结果与已有报道结果一致，此外本试验分离的藏羊源枯草芽孢杆菌上清液对沙门菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、产气荚膜梭菌均有一定的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌抑制较为显著。藏羊源枯草芽孢杆菌分离菌株延滞期较短，2～6 h为对数生长期，能够在较短时间内达到最大生长量，有助于缩短发酵时间，可降低生产成本。本试验分离的枯草芽孢杆菌菌株生长特性与满丽莉等[18]从中国豆豉中和袁宗胜等[19]从毛竹体内分离筛选出的枯草芽孢杆菌不同，可能是由于菌株来源不同、存在种内差异的原因。本试验分离的菌株对四环素和多肽类多黏菌素B表现为中度敏感，且对β内酰胺类、氨基糖苷类和大环内酯类抗菌药等绝大多数临床用药有良好的敏感性，这与杜汉宇等[20]、刘晓燕等[21]的报道相似，说明分离菌株可能不存在耐药基因，因此在应用时携带或转移耐药基因的风险较低。通过耐高温和耐酸试验发现，与陈曦等[22]报道的猪肠源枯草芽孢杆菌的耐高温结果相同的是分离菌株随着水浴温度的升高，存活率明显下降，不同的是分离菌株在水浴处理30 min后的存活率较低，而在培养24 h后菌株存活率大幅度上升；与白海等[23]研究报道的绵羊源枯草芽孢杆菌于pH 2.0处理2.5 h后存活率会下降至43.9%不同，本试验分离得到的藏羊源枯草芽孢杆菌在酸性环境下存活率较低，但对中性偏碱的环境具有一定的抵抗力；可能是由于菌株来源不同使得其生物学特性有所不同，造成了耐受性的差异性。

综上所述，枯草芽孢杆菌作为高原生境孕育的独特的芽孢杆菌资源，具有良好的生物学特性，有望成为青海藏羊源微生态制剂开发的潜在候选菌株。