野猪源猪圆环病毒4型的发现及其Cap基因序列分析

吴欢生，王飞兵，杨 艳，周光斌，陈 晨，徐田放，周贝怡，陈依婷，薛美佳，曹华斌*

（1.江西省畜禽疫病诊断与防控重点实验室/江西农业大学 动物群发性疾病监测与防治研究所，江西 南昌 330045；2.江西省金溪县农业农村局农业技术推广中心，江西 抚州 344800；3.江西省农业技术推广中心，江西 南昌 330096；4.江西省丰城市农业农村局，江西 丰城 331100；5.厦门海关技术中心，福建 厦门 361000）

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子无囊膜，基因组为单股负链环状DNA，是目前已知最小的动物病毒[1-2]。目前，已发现猪圆环病毒1 型（PCV1）[3]，猪圆环病毒2型（PCV2）[1]和猪圆环病毒3 型（PCV3）[4]。2019 年我国首次发现了一种新型PCV，命名为Porcine circovirus type 4（PCV4），随后，国内多个研究团队调查国内各省份（河南、山西、广西、江苏等）均存在PCV4 的流行[5-9]。PCV宿主范围较广，PCV1、PCV2最先在野猪中发现，于2018年证实PCV3可以感染野猪[10-11]，可见野猪在圆环病毒感染与传播中起重要作用，那么PCV4能否感染野猪？基于此，本研究采集江西省多个山区野猪组织样品，经PCR 方法检测PCV4，同时扩增阳性样品中的全长Cap 基因，并对其进行同源性及遗传进化分析，为丰富PCV4 的流行病学资料提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 病毒株及样品来源根据PCV4 全基因组序列HNU-AHZ-2019（MN162710）合成PCV4全基因组，并由北京擎科生物科技有限公司合成；25 份野猪组织样品包含7 份淋巴组织、8 份肾脏组织、5 份脾脏组织、5 份大肠组织，采集自江西省不同山区，均来源于不同野猪，样品保存于干冰中运送至江西省畜禽疫病诊断与防治重点实验室-80 ℃保存备用。

1.2 主要试剂2×RapidTagMaster Mix 购自南京诺威赞生物科技有限公司；2×T5 Fast qPCR Mix、DL2000 DNA Marker 及病毒基因组DNA 提取试剂盒购自北京擎科生物科技有限公司；DNA 回收试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 引物的设计与合成参照GenBank 中PCV4 基因组序列HNU-AHZ-2019（MN162710）设计一对普通PCR 扩增引物Cap-F/Cap-R（表1），扩增Cap 全长基因；参照文献[6]合成PCV4 特异性探针法qPCR 的探针（PCV4-P）和引物（PCV4F/PCV4R）（表1），引物和探针均由北京擎科生物科技有限公司合成（长沙）。

1.4 样品的qPCR 检测及阳性样品Cap 基因的PCR扩增取少许各组织样品，加入少许无菌PBS，利用组织匀浆机充分打碎匀浆，反复冻融3 次充分释放病毒，12 000 g 离心后，取上清，利用病毒基因组DNA 提取试剂盒提取总DNA 作为模板，利用表1 中的引物，采用PCV4TaqMan qPCR 方法检测，以无菌双蒸水作为阴性对照，以合成的PCV4 基因组为阳性对照。扩增程序如下： 95 ℃30 s， 95 ℃5 s，共40个循环，60 ℃1 min收集荧光信号。根据上述结果选择3 份阳性样品和部分阴性样品的DNA 经表1 中的引物采用常规PCR 扩增PCV4 Cap 基因，PCR 产物由北京擎科生物科技有限公司测序（长沙）。

表1 本研究所用的引物和探针Table 1 Primers and probes used in this study

1.5 Cap 基因及氨基酸序列的同源性及遗传进化分析采用DNAStar 软件分析本研究获得的野猪源PCV4 Cap 基因序列，并利用DNAStar 软件分析这3 个Cap 基因与22 株圆环病毒Cap 基因的同源性。采用分子遗传进化软件MEG6 构建Cap 基因的进化树并分析其遗传进化关系。

2 结果与讨论

2.1 野猪样品PCV4 的qPCR 检测结果PCV4Taq⁃Man qPCR 法的扩增结果显示，阳性对照扩增出一条特异性S 型曲线，Ct 值为20.365，而阴性对照呈现一条水平直线，无Ct 值，表明该检测方法有效。25 份野猪样品的检测结果显示，其中有3 份样品出现扩增曲线，分别为淋巴结、肾脏和脾脏样品。Ct值分别为26.405、29.211、31.787，其余样品均未出现扩增曲线（图1），阳性率为12%（3/25），表明野猪中存在PCV4 的感染。目前，有关野猪感染猪源病毒的文献较多，野猪可携带或感染多种病原，并造成传播，如猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、PCV 包括PCV1、PCV2和PCV3 等[12-16]，本研究首次在野猪组织中检测到PCV4，推测野猪可作为混合器携带并传播多种PCV。

图1 野猪样品PCV4 的qPCR检测结果Fig.1 The detection result of PCV4 from wild boars by qPCR assay

2.2 野猪阳性样品PCV4 Cap 基因的PCR 扩增结果选取上述3 份阳性和8 份阴性样品经常规PCR 扩增，结果显示3份阳性样品均扩增出约1 300 bp的目的条带，其余阴性样品均未扩增出该目的条带（图2），扩增片段位于PCV4 基因组464 nt～1 737 nt，覆盖Cap全长基因。测序结果显示，扩增片段均为PCV4 Cap全长基因，分别命名为JXNC-2020、JXYC-2020及JXGZ-2020，序列上传NCBI 获得登录号分别为MW988110、MW988111、MW988112。本研究首次在野猪组织中扩增并获得PCV4 Cap 基因序列。Zhang 等首次报道PCV4 为环状基因组结构[9-11]，直接扩增PCV4 全长基因组较为困难，本研究经多种尝试直接扩增PCV4 全长基因组均未成功，继而选择分段扩增。国内有多个研究团队均是采用PCR 分段扩增方法扩增了家猪源的PCV4 全长基因组[12-16]，这可能与PCV4 基因组的特殊结构有关，本研究经PCR 扩增获得了Cap全长基因，Cap蛋白为PCV4的衣壳蛋白，能够诱导机体产生保护性抗体，Cap 全长基因的获得为研究PCV4衣壳蛋白的多样性奠定了基础。

图2 野猪组织样品的PCV4 PCR扩增结果Fig.2 Traditional amplification of PCV4 in wild boars tissues samples

2.3 野猪源PCV4 Cap 基因的同源性分析 同源性分析结果显示，3 个野猪源PCV4 Cap 基因序列之间的同源性为98.69%～100%，氨基酸序列的同源性为97.1%～100%。与GenBank 登录的4 个家猪源PCV4 Cap基因序列的同源性为98.54%～99.13%，氨基酸序列的同源性为97.37%～99.12%，与其中韩国流行株E115 Cap 基因序列的同源性为98.11%～98.54%，氨基酸序列同源性为96.93%～98.25%。野猪源与国内家猪源PCV4 Cap 基因序列的同源性高于其与韩国流行株的同源性。表明野猪源PCV4 与国内家猪源PCV4 亲缘关系更近，推测国内PCV4 可能在家猪与野猪间流行并传播。氨基酸序列分析结果显示，与韩国流行株E115 相比，JXNC-2020 和JXYC-2020 均存在3 个突变氨基酸，分别为R14W、N25S 和K69E；与韩国流行株E115 相比，JXGZ-2020 存在7 个突变氨基酸，分别为R14W、N25S、K69E、L100P、T110I、H137Y 及M211P；与国内家猪源PCV4 相比，野猪源PCV4 Cap 蛋白氨基酸序列的突变数少于其与韩国流行株相比。上述氨基酸突变可能会导致Cap 蛋白的抗原性发生变异。2019年我国首次在家猪检出PCV4，随后韩国也发现PCV4[17]。西班牙和意大利的300 多份野猪样品的筛查结果显示均无PCV4 阳性样品[18]。我国野猪源PCV4与国内家猪源PCV4 Cap 基因序列同源性高于其与韩国流行株的同源性，表明，野猪可能参与了国内PCV4 的流行与传播，也提示野猪可以充当活动载体传播PCV4，且国内家猪、野猪可以互相传播PCV4。

2.4 野猪源PCV4 Cap 基因的遗传进化分析基于圆环病毒Cap 基因的进化树结果显示，22株圆环病毒形成两大分支，野猪源PCV4 Cap基因与12株圆环病毒（包含家猪源PCV4、PCV1、PCV2及蝙蝠相关圆环病毒等）Cap 基因形成一大分支，且与4个家猪源PCV4 Cap基因处于一小分支；PCV3与其他9株圆环病毒（包含犬圆环病毒等）的Cap基因形成另一大分支（图3），进一步表明野猪源PCV4 与家猪源PCV4 亲缘关系较近。

图3 基于Cap基因构建的圆环病毒遗传进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on Cap gene of circovirus

野猪作为重要活动载体，参与了多种猪病病毒的传播与扩散，目前已发现4 种PCV，其中PCV1/2/3均已报道可以感染野猪，本研究首次在野猪中发现PCV4，推测野猪可以作为混合器传播多种PCV，为PCV的流行病学调查及其感染的防控带来新挑战。

总之，本研究首次发现我国野猪存在PCV4 的感染，丰富了PCV4 的自然宿主范围，为进一步理解PCV4 跨物种传播及其感染的防控提供科学依据。