菌群失调在子宫内膜异位症中的研究进展

田 琦，易晓芳

(复旦大学附属妇产科医院，上海 200011)

子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)简称“内异症”,是一种常见的激素依赖性疾病。EMs常合并疼痛和不孕，严重影响育龄期妇女的身心健康[1]。EMs的发病机制尚不明确,除了经典的“经血逆流”假说以外，遗传和氧化应激导致的免疫失常也被认为参与了EMs的发生发展[2]。随着基因测序技术的进步，越来越多的研究发现，构成人体的微生物群约1014种，即细菌、古菌、原生动物、真菌及病毒等(其集体基因组被命名为“微生物组”[3])，能调节食物代谢、维持肠上皮黏膜的完整性，菌群失衡会导致多种疾病的发生，如肠道菌群失衡易致炎症性肠病、结肠癌，而EMs的发生发展可能与菌群失衡有关[4-6]。

1 菌群失调参与EMs发生发展的证据

1.1 临床前研究

1.1.1 恒河猴 Bailey等[7]通过差异/选择性培养基培养发现，自然发病的内异症恒河猴较对照组粪便中乳杆菌数量显著减少[F(1,14)=6.09，P<0.05]，革兰氏阴性需氧菌和兼性厌氧菌数量明显增加[F(1,14)=8.69，P<0.01]，且内异症恒河猴肠道炎症的患病率更高[χ2(1)=22.97,P<0.001]。

1.1.2 内异症模型鼠 C57BL6是内异症建模最常用的鼠系。Chadchan等[8]通过腹腔缝合种植自体子宫内膜的方式成功建模，21天后发现小鼠粪便中拟杆菌相对丰度增高，厚壁菌相对丰度降低。Ni等[9]采用腹腔注射同源异体小鼠子宫内膜的方法成功建模，同样在21天检测发现内异症组与对照组厚壁菌/拟杆菌的比率为2.25∶2.01，变形菌、疣微菌丰度增加，拟杆菌、乳杆菌丰度降低(均P<0.05)。Hantschel等[10]也采用腹腔注射的方式建模，在21天却未见建模组与对照组粪便菌群组成的统计学差异，考虑为其建模移植率仅为(23.8±4.2)%所致。Yuan等[11]也采用同样方式建模，直到建模42天时才发现建模组粪便中双歧杆菌丰度增加(P<0.05)，且厚壁菌/拟杆菌比例约为对照组的2倍(P=0.0028)。上述动物实验结果有矛盾之处，但考虑动物来源、建模方式、饲养条件、取样时间等存在差异，还需进一步大样本的临床研究来明确其临床意义。

1.2 临床研究 如表1所示，内异症与对照组之间在临床样本中存在菌群表达的差异。

1.2.1 粪便 Ata等[12]研究发现，III～IV期内异症患者(14例)粪便样本中加德纳菌、纤毛菌显著降低(均p<0.05)。Shan等[13]发现III～IV期内异症患者(12例)粪便中厚壁菌/拟杆菌比例增加(3.55 vs 1.99)，双歧杆菌、链球菌、Blautia菌和Dorea菌丰度增加。Svensson等[14]发现，内异症患者(66例)粪便中拟杆菌丰度降低，毛螺菌、瘤胃菌丰度增加(均P<0.05)。

1.2.2 宫颈、阴道分泌物 Ata等[12]发现，III～IV期内异症患者阴道和宫颈分泌物中完全没有奇异菌属。而排除乳杆菌(下生殖道主要细菌)后的敏感性分析发现，内异症组加德纳菌含量更高(P<0.05)。Akiyama等[15]发现，III～IV期内异症患者(30例)宫颈黏液中链球菌、肠杆菌数量明显高于对照组(均P<0.05)。Perrotta等[16]在卵泡期和月经期分别对内异症(35例)与非内异症患者(24例)粪便、阴道分泌物进行比较分析，却未见菌群表达的明显差异。

1.2.3 经血、在位内膜/异位病灶 Khan等[17]发现，内异症妇女(20例)D1～3天经血培养出的大肠杆菌菌落形成单位(CFU)、经血/腹腔液中的内毒素水平明显高于对照组(均P<0.01)，且腹腔液中内毒素水平在月经期最高，考虑内异症女性的经血受到大肠杆菌的高度污染。他们还发现，内异症妇女(65例)阴道pH≥4.5的患病率更高(范围4.5～9.0；79.3 vs 58.4%，P<0.03)，且其子宫内膜样品培养出的致病菌属(如加德纳菌、肠球菌、链球菌和大肠杆菌)菌落形成单位数(CFU/mL)和>1000个的集落形成比例(81.5% vs 41.5%，P<0.05)显著高于非内异症女性(53例)，提示内异症妇女的子宫内膜样本更易发生细菌定植(P=0.03，χ2检验)，即发生了亚临床感染[18]。而卵巢子宫内膜异位症囊液较非卵巢子宫内膜异位症(各8例)囊液中链球菌、葡萄球菌的检出率明显升高，乳杆菌检出率明显降低(均p<0.05),且卵巢子宫内膜异位症囊液的菌群组成与在位内膜大致相似[19]，作者据此提出“细菌污染假说”作为内异症的潜在发病机制[20]。Wei等[21]则发现，内异症患者(36例)在位内膜和腹腔液中的鞘氨醇杆菌和假单胞菌显著富集(P<0.05)。而Hernandes等[22]同样发现异位病灶(18例)中高丰度的假单胞菌和肠球菌。

1.2.4 腹腔液、腹膜 Campos等[23]专门研究了柔膜菌纲的人型支原体、生殖道支原体、解脲脲原体和微小型支原体，发现内异症组(73例)腹腔液中检测到的解脲脲原体与患者的性交困难(VAS≥7;P=0.019)呈正相关，且内异症组腹腔液细胞中与炎症反应相关的多个基因表达下调，而在有生殖道支原体感染的情况下这种下调更加明显。Lee等[24]发现，卵巢子宫内膜异位症患者(45例)腹腔液细胞外囊泡中的不动杆菌、假单胞菌和链球菌丰度显著增加，而丙酸杆菌、放线菌和罗氏菌的丰度显著降低(P<0.05)。虽然目前关于内异症相关临床样本菌群的检测已开展很多，但受限于检测设备、取样方法、测序分析等，仍没有得到一个公证的差异表达的细菌用于内异症的早期预测和诊断。

表1 子宫内膜异位症与对照组之间在临床样本中菌群表达的差异

2 菌群参与内异症发生的可能机制

2.1 子宫内膜的微生物或许来自以下传播途径 (1)肠道和口腔等的微生物或其他部位的细菌通过血源传播；(2)阴道宫颈的细菌上行传播；(3)与生殖技术有关的辅助操作，如取卵、子宫内装置的放置或取出，或通过从子宫延伸穿过颈管的“尾丝”帮助传播[25-26]。

2.2 菌群可能通过以下途径参与内异症的发生

2.2.1 细菌与Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)结合促进炎症反应和细胞黏附 受大肠杆菌污染的经血中细菌内毒素浓度升高，经血逆流入盆腹腔后,与腹腔巨噬细胞、在位和异位子宫内膜上皮细胞及上皮基质细胞表达的LPS受体(TLR4)结合，LPS/TLR4复合物通过激活B细胞的细胞内适配分子和核因子活化B细胞κ轻链增强子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-kB)引起盆腔炎症促进内异症的生长和发展[17,20]。而尿支原体可与TLR2结合，激活ERK和JNK通路诱导腹膜间皮细胞和子宫内膜基质细胞产生和释放炎症因子、趋化因子(IL-6、TNF-α、CXCL1和CCL2等)和黏附分子(ICAM-1和VCAM-1)等促进子宫内膜在盆腔的黏附生长[23,27]。

2.2.2 细菌参与雌激素循环的调节 早在关于肿瘤的研究中就有学者提出“estrobolome”，即“雌激素组”的概念，是指能代谢雌激素的肠道菌群基因的集合，包括拟杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌和乳杆菌属等[28]。这部分细菌分泌的β-葡萄糖苷酸酶能将雌激素解偶联为其活性代谢物，导致循环中雌激素水平升高，而高雌激素水平与内异症的发生发展密切相关[29]。Shan等[13]发现，内异症患者血清E2水平显著升高(P<0.05),且与粪便中Blautia菌属丰度[R=0.69，P<0.05]和Dorea菌属丰度[R=0.61,P<0.05]呈正相关。

2.2.3 细菌通过其代谢产物(或)改变肠道代谢产物影响盆腔炎性反应 已有研究证实，来自鱼类、坚果等的多不饱和脂肪酸(如omega-3脂肪酸和omega-6脂肪酸)可通过调节肠道菌群的组成改变其代谢活性，减少炎性前列腺素和细胞因子(IL-1、IL-2和IL-6，TNF-α)等的释放，抑制内异灶的增殖[30]。而菌群的代谢产物如短链脂肪酸(SCFA)、氧化三甲胺(TMA)和次级胆汁酸等参与多条宿主的代谢通路，也可能作为内异症的潜在发病机制之一[9,13,31]。

3 菌群用于治疗EMs的前景

调整肠道菌群或许可抑制内异症的生长。Chadchan等[8]研究发现，无论是建模前后应用广谱抗生素(万古霉素、新霉素、甲硝唑和氨苄西林)还是单用拟杆菌敏感的甲硝唑处理内异症模型小鼠3周，内异症组小鼠病变部位的体积都明显小于对照组(均P<0.01)。而一项针对40例III～IV期内异症女性的随机对照实验发现，服用乳酸菌8周后患者痛经VAS评分下降幅度明显大于安慰剂组(3.46±2.97 vs 2.18±1.06，P=0.018)[32]。另有研究证实，加氏乳杆菌OLL2809作为一种益生菌，可通过刺激内异症模型鼠脾细胞产生IL-12激活自然杀伤(natural killer cell，NK)细胞，抑制内异症病变的发展[33]。

4 争议与展望

由于只有不到1%的微生物可在琼脂平板上生长和形成菌落，因此基于16S核糖体-RNA的新一代高通量测序技术NGS(Next-generation sequencing technology)已成为鉴定微生物群的常用方法。虽然测序水平高速发展，但仍有很多影响微生物检测的因素：包括可能的个体、群体因素(年龄、性别、病史、地域和遗传、月经周期和激素、BMI和饮食、生活习惯等)[34-36]；更不能忽视实验设计中的技术因素：不同的方案和培养条件、实验室和试剂污染、取样方法、测序、数据分析等都会导致差异[6，37]。且迄今为止基于NGS的研究集中于检测微生物DNA序列，尽管此方法提供了相关可能存在的微生物，但仍需明确存在DNA序列并不等同于存在活细菌[38]。因此，内异症与正常对照之间到底是否存在差异表达的菌群仍有争议,且菌群如何通过免疫调节诱导免疫耐受在宿主体内持续存在仍不清楚。

究竟内异症患者中菌群失调现象是因还是果?粪便菌群移植(fecal microbiome transplantation，FMT)通过内窥镜灌肠或鼻空肠管直接引入体内或是将微生物组封装在可吞咽的抗胃液的胶囊中)[39]正越来越多地用于复发性难治艰难梭菌肠炎的治疗，健康供体的阴道微生物组移植(vaginal microbiome transplantation，VMT)也已作为有症状的、顽固复发性细菌性阴道病的患者的替代方案[40],那么针对改变子宫菌群的治疗措施可否作为未来内异症的治疗方法?事实上，子宫作为低生物载量的生态位，支持其在没有病理性感染的情况下存在微生物组的证据仍不充分[41]。虽然微生物与内异症的双向作用仍未明确，相信将来通过新一代测序技术分析，关于内异症发病机制的新观点可能会被证实。这为开发全新的内异症预防，诊断，治疗方法都提供了可能。