UPLC-Q-TOF-MSE法分析黄精在九蒸九晒过程中的差异代谢物

2022-01-27梁泽华潘颖洁邱丽媛徐晓强舒月文

中成药 2022年1期

梁泽华，潘颖洁，邱丽媛，袁强，徐晓强，舒月文

(1.浙江中医药大学药学院，浙江杭州 311400;2.浙江枣椿堂农业发展有限公司，浙江龙游 324402)

黄精为百合科植物滇黄精PolygonatumkingianumColl. et Hemsl.、黄精PolygonatumsibiricumRed. 或多花黄精PolygonatumcyrtonemaHua 的干燥根茎，味甘、性平，入脾、肾、肺经，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾的功效[1]，常用于治疗肺虚燥咳、肾精亏虚、腰膝酸软[2]以及脾胃虚弱之症，具有滋补强身之功效。现代药理研究证明，黄精具有增强免疫、降血糖、降血脂、抗高血压、抗肿瘤、抗氧化等药理作用[3-8]。

黄精用药历史悠久，常以口服单用作用滋补，但生品具有咽喉刺激性及麻舌感，因此常以炮制品入药，其中蒸九晒品作为“四大蒸货”之一，其刺激性成分黄精黏液质含量明显降低[9]，补益功效增强，有利于患者的服用。但九蒸九晒品的功效目前主要依据传统的临床经验，缺乏科学全面的理论依据，而且工艺复杂，耗时长，对于其蒸晒次数的标准尚存在争议。

因此，本实验采用UPLC-Q-TOF-MSE技术结合多元统计分析，筛选并识别黄精九蒸九晒过程中的差异性成分[10-17]，为相关炮制机制的研究提供物质基础。

1 材料

1.1 药材黄精(产地浙江龙游)由浙江枣椿堂农业发展有限公司提供，经浙江中医药大学黄真教授鉴定为百合科植物多花黄精PolygonatumcyrtonemaHua的干燥根茎。

1.2 试剂甲醇(国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(德国默克公司)；甲酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.3 仪器 SYNAPT G2-Si高分辨四级飞行时间串联液质联用仪(美国沃特世公司)；RE52-99旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；150T多功能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司)；KQ-300DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

2 方法

2.1 药材炮制取生品适量，除去杂质，洗净，将黄酒与其搅拌均匀，并闷润至吸尽(每100 kg水平用黄酒20 kg)，要求第1次蒸制至黄精中央发虚，放在太阳下晒至药材外皮微干，之后将上一步生品拌入收集的汁液和一定量黄酒，并“闷润至辅料被药材吸尽”，按第1回蒸制、干燥方法处理，放到太阳底下晒至药材表面微干，再拌入上一步收集的汁液和一定量黄酒，同法连续操作，得到一蒸一晒品、三蒸三晒品、五蒸五晒品、七蒸七晒品、九蒸九晒品，置于60 ℃烘箱中烘干。

2.2 预处理取“2.1”项下生品和炮制品，分别精密称取(过四号筛)4 g，加入70%乙醇100 mL，超声提取30 min，共2次，合并滤液，减压浓缩，70%甲醇复溶，PSL固相萃取小柱，20 mL甲醇活化，20 mL超纯水洗涤，取5 mL倒入固相萃取小柱中，20 mL超纯水淋洗，40 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，70%甲醇复溶并定容至25 mL，12 000 r/min离心取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液，置于4 ℃冰箱中保存。

2.3 LC-MS分析条件

2.3.1 色谱 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流动相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～8 min，5%～21%A；8～17 min，21%～22%A；17～20 min，22%～40%A；20～30 min，40%～45%A；30～40 min，45%～73%A；40～45 min，73%～100%A；45～47 min，100%A；47～47.1 min，100%～5%A；47.1～50 min，5%A)；体积流量0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量0.5 μL。

2.3.2 质谱 SYNAPT G2-Si Q-TOF质谱仪；MSEcontinuum模式；扫描范围m/z50～1 500。在ESI-模式下；毛细管电压3.00 kV；锥孔电压40 V；温度120 ℃时锥气孔体积流量50 L/h；温度400 ℃时脱溶剂气体积流量800 L/h。以1 ng/μL亮氨酸-脑啡肽(ESI-,m/z555.261 5)为校正标准液。

2.3.3 化学成分数据库建立从Sciencedirect、Web of Science、CNKI、TCMSP等数据库收集黄精属植物化学成分及期名称，采用Masslynx V4.1软件中的Molecular Weight Calculator工具计算相对分子质量，建立包括名称、分子式、相对分子质量、[M-H]-、[2 M-H]-、[M-H+HCOOH]-等信息的数据库。

2.4 数据处理取生品、炮制品溶液各200 μL，制成质控(QC)样品。进样前先运行5个QC样品以使仪器稳定，然后每进9个样品运行1次，监测仪器稳定性和重复性。所采集的原始数据先通过Progenesis QI软件进行峰对齐、峰提取、峰鉴别、归一化等预处理，再将数据矩阵导入SIMCA 14.0软件，进行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)。

3 结果

3.1 多元统计分析 “2.1”项下生品和炮制品中共得到7个主成分，累积R2X=0.892，Q2=0.815，表明模型具有良好的预测能力。图1显示，QC样品高度集中，表明该方法稳定可靠；七蒸七晒品与九蒸九晒品重叠，未达到明显分离，而其余样品分布在不同区域，表明两者代谢产物相似，与其余样品之间存在差异。图2显示，除了七蒸七晒品与九蒸九晒品之间存在交叉，其余样品区分明显，组内平行样品成分接近。

注：1为生黄精，2为一蒸一晒品，3为三蒸三晒品，4为五蒸五晒品，5为七蒸七晒品，6为九蒸九晒品。图1 生品和炮制品PCA得分图

图2 生品和炮制品聚类热图

为了鉴别造成生品和炮制品之间分离的主要差异代谢成分，又建立了OPLC-DA模型，见图3，可知R2Y、Q2均大于0.9，表明模型构建良好，预测性可靠。

3.2 差异代谢成分筛选和鉴别通过OPLS-DA分析得到S型图(S-plot，图4)和变量重要性投影(VIP)值，以VIP值>1、P<0.05为条件筛选寻找差异代谢物，对比自建黄精化学成分数据库和ChemSpider数据库，同时根据所获得的精确相对分子质量结合色谱保留行为、质谱裂解规律、特征碎片离子以及相关文献报道，最终鉴别出37种差异代谢物，包含19种甾体皂苷、5种脂肪酸、3种黄酮、2种糖类、2种木脂素、2种有机酸、1种氨基酸、1种生物碱、2种未知成分，见表1。

倍数变化(FC)代表炮制品、生品中代谢物含量的比值，FC>1代表前者含量高于后者，FC<1代表后者含量低于前者。表2、图5显示，以pratioside H、sibiricoside A 为代表的大分子原生苷含量随着炮制时间延长不断降低，tianshic acid、palmitic acid等小分子化合物含量升高，鹅掌楸苷、橙皮苷等成分含量先升后降。

5 讨论与结论

注：A为生品与一蒸一晒品，B为生品与三蒸三晒品，C为生品与五蒸五晒品，D为生品与七蒸七晒品，E为生品与九蒸九晒品。图3 生品和炮制品OPLS-DA得分图

九蒸九晒品作为药食同源之品具有很高的养生价值，但生品具有咽喉刺激的副作用，九蒸九晒后可降低咽喉刺激性，增强补益功效，然而对其炮制机制的探索尚不明确，本实验对黄精生品、一蒸一晒品、三蒸三晒品、五蒸五晒品、七蒸七晒品、九蒸九晒品进行代谢组学分析，对黄精九蒸九晒过程中的化学成分进行识别分析，最终鉴定了37个差异代谢产物，其中甾体皂苷类成分占差异代谢产物的51.4%，为主要差异成分，而19个甾体皂苷类成分中，26-三醇-3-O-β-石蒜四糖苷及其异构体、甲基薯蓣皂苷及其异构体等10个成分在黄精九蒸九晒过程中呈现下降趋势，推测甾体皂苷在九蒸九晒过程中遇热水解，脱去糖基形成了次级苷或苷元；polygonatumoside F及其异构体等8个成分在黄精九蒸九晒过程中呈现先上升后下降的趋势，而kingianoside A及其异构体是黄精九蒸九晒过程中呈上升趋势的甾体皂苷、推测与大分子原生苷脱去糖基后的次级苷及其异构体的产生，以及进一步脱去糖基有关。同时，筛选所得的黄精黄酮类成分在九蒸九晒过程中呈现先上升后下降的趋势，异甘草素及其异构体与2′,7-二羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷及其异构体在一蒸一晒品中的含量最高，而橙皮苷及其异构体三蒸三晒品中的含量最高，甾体皂苷类成分和黄酮类成分作为黄精主要药效成分，具有降血糖、调节免疫、抗肿瘤等功效，但是对其单一成分的药效研究并不多见，本研究表明黄精九蒸九晒主要差异成分多为甾体皂苷、但与黄精九蒸九晒过程中的药效变化规律之间的关系尚且需要进一步探索。