超高效液相色谱—串联质谱法同时测定饲料中3种氯丙那林异构体和巴氯芬

李阳等

摘要：以溶剂提取固相萃取为前处理方式，建立了超高效液相色谱串联质谱法检测饲料中3种氯丙那林异构体和巴氯芬的新方法。试样用0.1 mol/L HCl甲醇（4∶1， V/V）溶剂振荡提取20 min，离心去杂质后由MCX柱净化、浓缩，经Waters BEH C18色谱柱梯度洗脱分离，串联质谱法测定，正离子扫描，并以外标法计算结果。方法检出限为20 μg/kg，定量限为50 μg/kg。4种目标化合物在3个添加水平上进行回收实验，回收率均在80%～110%之间；相对标准偏差均小于或等于10.2%。

关键词：饲料； 氯丙那林； 异构体； 巴氯芬； 超高效液相色谱串联质谱

1引言

氯丙那林（Clorprenaline）属于β2受体激动剂类药物，医学上主要用于扩张支气管和增加肺通气量，可治疗哮喘和肺炎。将其添加到饲料或动物饮用水中饲喂动物能够起到提高酮体瘦肉率，促进动物生长的作用[1]，是近年来发现的新型“瘦肉精”替代品[2]。巴氯芬（Baclofen）属于镇静剂类药物，主要用于骨骼肌松驰，缓解痉挛及外伤等[3]，在畜牧养殖过程中使用能够抗惊厥、减少动物营养消耗、增加体重，该药物也是近些年在动物产品安全监管中新发现的违禁添加物。食用含有氯丙那林和巴氯芬的动物产品易出现毒副作用，对人体健康造成一定程度损害。2002年，我国农业部已发布176号公告明令禁止在畜牧养殖过程中使用β2受体激动剂和镇静剂类药物。但是，仍有一些新型药物被违法添加使用的现象出现。因此，建立相应检测方法是很有必要的。

目前，关于氯丙那林和巴氯芬的检测方法已有报道，实验样品主要有饲料[4]、血清[5]、尿液[6]、组织[7]、原料药[8]、牛奶[9]等。色谱法是主要的分离方法，包括反相液相色谱法[1，2，5，8，9]、离子色谱法[10]、气相色谱法[11]以及毛细管电泳法[12]等。常用的检测器包括荧光检测器[12，13]、紫外检测器[1，8，13]、电导检测器[10]及质谱[5～7，9，11，14]等。在饲料中违禁药物监测过程中，经常应用单四级杆质谱进行非针对性筛查，以发现违禁添加物。由于氯丙那林和巴氯芬的理论分子量分别为213.7069和213.6635（由Waters Masslynx 4.1 Molecular calculator计算得到），二者数值接近，如果应用一级质谱筛查，则难以对二者进行准确定性。此外，氯丙那林含有苯环一氯取代结构，存在邻、间、对位置异构体，在色谱分离上有不同保留时间的差异，如果只应用其中一种异构体的保留时间进行确证，容易将异构体判定为非目标化合物，给违禁药物监管带来漏洞。图1为巴氯芬和3种氯丙那林异构体结构式。本研究采用溶剂提取后，经固相萃取净化、浓缩，反相液相色谱串联质谱测定，通过优化前处理方法以及仪器检测参数，建立了针对巴氯芬和3种氯丙那林异构体的检测方法。本方法适用于饲料实际样品分析，结果准确、灵敏。

3结果与讨论

3.1质谱和色谱条件优化

氯丙那林为β2受体激动剂类药物，属于碱性化合物，pKa>7[15]；巴氯芬为酸碱两性化合物，在水中pKa值为3.87和9.62[16]。4种目标化合物均可采用正离子电离模式和反相液相色谱分离。通常向流动相中添加适量甲酸将有助于碱性物质电离，并使目标化合物色谱柱保留时间提前。在此基础上，本研究分别采用乙腈0.1%甲酸、乙腈水、甲醇0.1%甲酸、甲醇水作为流动相，考察Acquity Uplc BEH C18和Acquity Uplc shield RP 18色谱柱对目标化合物色谱分离及质谱电离的影响。结果表明，流动相中添加甲酸后待测物质的信号强度明显提高，甲醇和乙腈作为流动相对信号强度影响并不显著。但使用乙腈时，间位氯丙那林和对位氯丙那林异构体分离度较差（图2A）。Acquity Uplc BEH C18和Acquity Uplc shield RP 18色谱柱对4种化合物均能实现基线分离，与后者相比，4种化合物在Acquity Uplc BEH C18上保留时间相对较长，巴氯芬与3种氯丙那林异构体更好地实现分离，去杂能力更强。图2C为使用Acquity Uplc BEH C18的分离效果图，图2B为使用Acquity Uplc shield RP 18色谱柱分离效果图。综合考虑检测时间、分离效果以及试剂毒性等因素，本研究采用甲醇0.1%甲酸溶液作为流动相，Acquity Uplc BEH C18色谱柱作为色谱条件。图2定量离子提取离子色谱图中4种化合物浓度均为1.0 μg/L。

质谱条件优化过程中，首先采用浓度为1.0 mg/L上述4种待测目标化合物标准溶液分别上机测定。在正离子模式下，进行母离子全扫描。确定分子离子，并对仪器电离电压、锥孔电压、碰撞能量等参数进行优化，确定两个子离子作为定性离子，并选择其中之一作为定量离子。

3.2样品前处理条件优化

氯丙那林和巴氯芬均具有弱碱性，在酸性条件下带正电，易被水、水溶性溶剂或它们的混合溶剂提取。提取液pH值和有机溶剂比例是影响提取效率的两大因素。本研究对比了添加浓度为50 μg/kg水平下，3种浓度HCl溶液混合不同比例甲醇的提取效果。图3为不同提取条件下的平均回收率，当提取条件为0.1 mol/L HCl甲醇（4∶1， V/V）时，目标化合物的回收率综合水平较高，均在85%～110%之间。由4种目标化合物回收率随HCl浓度及有机相比例变化趋势图可见，4种目标化合物在有机相比例为20%～50%范围内，回收率均较高，证明添加适量有机溶剂有助于目标物提取。当有机相比例小于50%时，HCl浓度对3种氯丙那林异构体回收率影响较大，回收率随HCl浓度增大而提高；但在此范围内，HCl浓度对巴氯芬回收率影响较小。当有机相比例大于50%时，随着有机相比例增加，目标化合物回收率呈下降趋势。当提取液为100%甲醇时，4种目标化合物回收率均较低。

本研究比较了C18柱、HLB柱、MCX柱、WCX柱的不同净化效果。结果表明，WCX柱对目标化合物保留效果较差，C18柱、HLB净化后杂质较多，基质效应较大。由于MCX柱是利用阳离子交换作用保留目标化合物，待测的4种化合物均为碱性化合物，pKa>7，在酸性条件下带正电，MCX对其柱具有较好的吸附作用。甲酸和甲醇不能将目标化合物洗脱，但能达到洗脱极性和非极性杂质的作用，所以选择甲酸和甲醇作为淋洗溶液。氨化甲醇是MCX柱常用的洗脱溶剂，为保证目标化合物完全被洗脱，本研究采用了5% 氨化甲醇溶液，洗脱体积为5.0 mL。综合以上条件， 选择0.1 mol/L HCl甲醇（4∶1， V/V）为样品提取溶液，经MCX柱保留后，使用0.2%甲酸和甲醇淋洗杂质，再用5%氨化甲醇洗脱，洗脱液杂质少，并且容易吹干，有很好的净化和浓缩效果。

3.3基质效应考察

采用提取后添加法定量测定空白基质提取液与纯溶剂中同浓度分析物的离子响应强度，通过公式ME（%）=基质溶液中分析物峰面积/纯溶剂中分析物峰面积，分别在3个不同浓度下评价基质效应。ME<1，基质对目标化合物的响应产生抑制作用；ME>1，基质对目标化合物的响应产生增强作用；ME=1，不存在基质效应。如图4所示，样品基质对4种分析物均有一定程度抑制作用，但在3个浓度水平下，ME均在80%～100%范围内，表明本研究所建立前处理方法去杂质效果较好。因此，可以采用纯溶剂标准溶液进行定量计算。

3.6实际样品检测

利用本方法对收集的21份饲料实际样品进行了检测（包括猪配合饲料5份，小、中、大猪用浓缩饲料6份，肉牛浓缩饲料2份，肉牛精料补充料2份，肉羊专用浓缩饲料2份，肉羊专用精料补充料2份，兔全价配合饲料2份），所有样品中均未检出4种目标化合物。

References

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本研究比较了C18柱、HLB柱、MCX柱、WCX柱的不同净化效果。结果表明，WCX柱对目标化合物保留效果较差，C18柱、HLB净化后杂质较多，基质效应较大。由于MCX柱是利用阳离子交换作用保留目标化合物，待测的4种化合物均为碱性化合物，pKa>7，在酸性条件下带正电，MCX对其柱具有较好的吸附作用。甲酸和甲醇不能将目标化合物洗脱，但能达到洗脱极性和非极性杂质的作用，所以选择甲酸和甲醇作为淋洗溶液。氨化甲醇是MCX柱常用的洗脱溶剂，为保证目标化合物完全被洗脱，本研究采用了5% 氨化甲醇溶液，洗脱体积为5.0 mL。综合以上条件， 选择0.1 mol/L HCl甲醇（4∶1， V/V）为样品提取溶液，经MCX柱保留后，使用0.2%甲酸和甲醇淋洗杂质，再用5%氨化甲醇洗脱，洗脱液杂质少，并且容易吹干，有很好的净化和浓缩效果。

3.3基质效应考察

采用提取后添加法定量测定空白基质提取液与纯溶剂中同浓度分析物的离子响应强度，通过公式ME（%）=基质溶液中分析物峰面积/纯溶剂中分析物峰面积，分别在3个不同浓度下评价基质效应。ME<1，基质对目标化合物的响应产生抑制作用；ME>1，基质对目标化合物的响应产生增强作用；ME=1，不存在基质效应。如图4所示，样品基质对4种分析物均有一定程度抑制作用，但在3个浓度水平下，ME均在80%～100%范围内，表明本研究所建立前处理方法去杂质效果较好。因此，可以采用纯溶剂标准溶液进行定量计算。

3.6实际样品检测

利用本方法对收集的21份饲料实际样品进行了检测（包括猪配合饲料5份，小、中、大猪用浓缩饲料6份，肉牛浓缩饲料2份，肉牛精料补充料2份，肉羊专用浓缩饲料2份，肉羊专用精料补充料2份，兔全价配合饲料2份），所有样品中均未检出4种目标化合物。

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本研究比较了C18柱、HLB柱、MCX柱、WCX柱的不同净化效果。结果表明，WCX柱对目标化合物保留效果较差，C18柱、HLB净化后杂质较多，基质效应较大。由于MCX柱是利用阳离子交换作用保留目标化合物，待测的4种化合物均为碱性化合物，pKa>7，在酸性条件下带正电，MCX对其柱具有较好的吸附作用。甲酸和甲醇不能将目标化合物洗脱，但能达到洗脱极性和非极性杂质的作用，所以选择甲酸和甲醇作为淋洗溶液。氨化甲醇是MCX柱常用的洗脱溶剂，为保证目标化合物完全被洗脱，本研究采用了5% 氨化甲醇溶液，洗脱体积为5.0 mL。综合以上条件， 选择0.1 mol/L HCl甲醇（4∶1， V/V）为样品提取溶液，经MCX柱保留后，使用0.2%甲酸和甲醇淋洗杂质，再用5%氨化甲醇洗脱，洗脱液杂质少，并且容易吹干，有很好的净化和浓缩效果。

3.3基质效应考察

采用提取后添加法定量测定空白基质提取液与纯溶剂中同浓度分析物的离子响应强度，通过公式ME（%）=基质溶液中分析物峰面积/纯溶剂中分析物峰面积，分别在3个不同浓度下评价基质效应。ME<1，基质对目标化合物的响应产生抑制作用；ME>1，基质对目标化合物的响应产生增强作用；ME=1，不存在基质效应。如图4所示，样品基质对4种分析物均有一定程度抑制作用，但在3个浓度水平下，ME均在80%～100%范围内，表明本研究所建立前处理方法去杂质效果较好。因此，可以采用纯溶剂标准溶液进行定量计算。

3.6实际样品检测

利用本方法对收集的21份饲料实际样品进行了检测（包括猪配合饲料5份，小、中、大猪用浓缩饲料6份，肉牛浓缩饲料2份，肉牛精料补充料2份，肉羊专用浓缩饲料2份，肉羊专用精料补充料2份，兔全价配合饲料2份），所有样品中均未检出4种目标化合物。

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