当归-川芎药对治疗阿尔茨海默病的生物信息学、网络药理学分析

尹曼雪， 吴庆光

(广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种发生于老年前期和老年、起病隐匿复杂的进行性发展神经系统退行性疾病[1]，又名老年痴呆症，其临床主要表现为认知功能、精神症状和行为障碍、日常生活能力下降[2]。随着老龄化进程加快、环境污染严重，AD发生率急剧上升，到2050年患者将增至1.52亿[3]。针对AD的治疗药物一直是研究热点，目前有5种被批准，均为乙酰胆碱酯酶抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂，但也只能减缓症状，无法改变本病进程[4]。

中医将AD归属于“呆症”“愚痴”“文痴”等范畴[5]，治疗本病时可发挥多靶点、多层次、多环节的综合作用。当归、川芎为临床常用补血活血中药，常在方剂中同时出现或者配伍成方，其中当归芍药散对AD有着良好的治疗效果[6-9]，方中川芎、当归发挥了“辛以润之”的药性，可改善因气化失司、营血瘀阻、肺卫失宣所致津血运行输布障碍、痰凝气滞血瘀之病机，从而达到防治目的，但目前其作用靶点和机制尚未明确。因此，本研究在辛润药性理论的指导下，采用生物信息学、网络药理学探讨当归-川芎药对治疗AD的关键基因和发病机制。

1 材料与方法

1.1 软件与数据库 中药系统药理学分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php/)；Gene Expression Omnibus(GEO)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)；RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)；Cytoscape软件(Version 3.7.2)；Rgui软件(Version 3.6.2)；MOE软件(Version 2015.10)。

1.2 方法

1.2.1 GEO数据获取 在GEO数据库中输入“Alzheimer’s disease”，获得GSE5281基因表达谱，含161例样本基因芯片数据，其中病例组(AD脑组织)87例，对照组(正常脑组织)74例。

1.2.2 AD差异基因筛选 利用Perl、R语言进行数据分析，根据数据样本特征进行背景校正和矩阵数据归一化处理，limma包分析芯片数据差异基因，筛选条件为P<0.05、|logFC|≥0.5，得到差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)[10-11]。采用plot包绘制火山图，pheatmap包绘制热图。

1.2.3 活性成分筛选与靶点预测 选取同时满足生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18[12]者作为潜在活性成分，通过TCMSP查找其相关靶点。

1.2.4 调控网络 采用Perl语言，将药物靶基因和筛选得到的疾病差异基因进行对比分析，得到交互靶标，再将化合物名称、靶基因名称、主要生物学功能及信号通路导入Cytoscape 3.7.2软件，绘制当归-川芎药对调控网络。

1.2.5 蛋白-蛋白相互作用网络构建 将药物和疾病的交互靶标基因名称导入Cytoscape 3.7.2软件，安装Bisogenet包构建蛋白相互作用(PPI)网络[13]，再安装CytoNCA包进行网络拓扑分析。

1.2.6 GO生物功能富集分析 采用Bioconductor平台和R软件，对网络合并后获得的靶标基因进行ID转换，并作GO富集分析，以P值评估存在于各GO注释中的蛋白质群，选择生物学过程(BP)、分子功能(MF)、细胞组成(CC)，绘制三者条形图。

1.2.7 KEGG代谢通路富集分析 应用Bioconductor平台和R软件，对药物-疾病交互的靶标基因进行KEGG代谢通路富集分析。

1.2.8 分子对接验证 通过检索TCMSP数据库获得当归-川芎药对活性成分mol2格式化学结构，检索RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)获得蛋白晶体结构，同时查找c-Jun、PPARG、NR3C1、RXRA、BCL2原始配体或者抑制剂。应用MOE 2015.10软件，对“活性成分-作用靶点”网络中的度值大于平均值的化学成分和PPI网络中的c-Jun、PPARG、NR3C1、RXRA、BCL2(c-JUN晶体结构PDB: 4W4V、PPARG晶体结构PDB: 3ADT、NR3C1晶体结构PDB: 4LSJ、RXRA晶体结构PDB: 3NSQ、BCL2晶体结构PDB: 4IEH)进行分子对接，获得相应的对接数据以及c-Jun、PPARG、NR3C1、RXRA、BCL2与其原始配体或者抑制剂的对接数据。通过对接能量(binding energy)的值评价活性成分和关键靶点之间的对接效果，平面分子之间相互作用图、三维立体相互作用模式图分析药物分子和蛋白晶体间的相互作用。

2 结果

2.1 DEGs筛选 在AD组织中筛选出4 674个基因差异表达，其中2 349个下调，2 325个上调，对程度最明显的20个基因进行排序并聚类分析，得到火山图和聚类图(图1，红色代表相对较高的表达，绿色代表相对较低的表达，黑色代表没有变化)。由此可知，DEGs能较好的区分出2个组，上调的基因基本在所有实验中logFC>0，而下调的基因基本logFC<0。

图1 差异基因的火山图和聚类图Fig.1 Volcano plot and dendrogram for DEGs

2.2 药物-疾病靶标预测 从TCMSP数据库中搜索到当归化合物125个、川芎化合物189个，根据OB≥30%、DL≥0.18最终选定9个，来源于当归的有2个，川芎的有7个，具体见表1。从TCMSP数据库获取所选化合物的靶标蛋白，并在UniProt数据库检索其对应的基因名，同时联合GEO数据库分析筛选得到的AD差异基因，得到两者交集基因9个，分别是PPARG、RXRA、NR3C1、CHRM1、GABRA1、BCL2、BAX、JUN、ADRB1。

表1 当归-川芎药对中的9个活性化合物

2.3 治疗AD调控网络构建 药物-化合物-作用靶点-疾病网络见图2，共14个节点，粉红色节点代表川芎主要活性化合物，黄色节点代表川芎主要活性化合物，蓝色节点代表代表潜在靶点，每条边表示化合物和靶点之间的相互作用关系。由此可知，β-谷甾醇、豆固醇、川芎萘呋内酯、杨梅酮、川芎哚在整个网络中发挥关键作用，可能是治疗AD的核心化合物。

图2 药物-化合物-靶点-疾病网络Fig.2 Drug-compounds-targets-disease network

2.4 PPI网络分析 PPI网络分析显示原始节点739个，根据度中心性[14-15](degree centrality，DC)>61进行筛选(图3)，共有80个节点、1 204条边，其中节点表示蛋白，度值表示连接到1个节点的线条数，橙红色表明度值大的交集基因节点；每条边表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系，线条越多，关联度越大。由此可知，JUN、NR3C1、PPARG、RXRA、BCL2、BAX度值显著高于其余交集靶点，其中JUN最大，可能是治疗AD最主要的潜在靶点。

图3 当归-川芎药对与AD交集靶点的PPI网络Fig.3 PPI network for intersection targets of Angelica sinensis-Ligusticum chuanxiong drug pair and AD

2.5 GO富集分析 GO富集分析确定了661个GO条目(P<0.05)，其中生物学过程(BP)最多，有556个，主要涉及膜电位调节、DNA模板转录、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的调控、信号转导、生殖系统发育、轴突损伤的反应等；分子功能(MF)有74个，主要涉及核受体活性、神经递质受体活性、G蛋白偶联神经递质受体活性、类固醇激素受体活性等；细胞组成(CC)有31个，主要涉及转录因子、突触后膜、突触、线粒体等。各取P值最高的前20名，以条形图(图4)展现，GO生物功能的显著性以其长度和颜色表示，长度越长，基因数目越多，条目重要性越大。

2.6 KEGG富集分析 KEGG富集分析共得到23条，P值较小的20条见表2。由此可知，相关机制主要涉及神经活性配体-受体相互作用通路、内分泌抵抗通路、糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、神经营养因子信号通路、细胞凋亡通路、非酒精性脂肪肝通路、cAMP信号通路、PI3K-Akt信号通路等。

图4 GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

2.7 分子对接 将“成分-靶标-通路”网络图中度值较高的5个化合物(β-谷甾醇、豆甾醇、杨梅酮、川芎哚、川芎萘呋酯)与网络中度值排名前5的靶点(c-Jun、PPARG、NR3C1、RXRA、BCL2)进行对接，并采用原始配体或抑制剂作为阳性对照，结果见表3。由此可知，β-sistosterol、stigmasterol、myricanone与c-Jun蛋白晶体的结合能均小于-10 kcal/mol，表明它们存在结合，但与原始配体(ID：3H8)相比有一定差距；β-sistosterol、perlolirine与PPARG蛋白晶体结构的结合能小于-10 kcal/mol，并且perlolirine与PPARG的特异性配体(ID：HID)在结合能方面较为接近，表明它可能与PPARG存在较好的结合；β-sistosterol、myricanone、perlolirine与RXRA蛋白晶体结合能均小于-10 kcal/mol，其中myricanone、perlolirine与RXRA原始配体(ID：CHZ)的结合能较为接近，提示两者可能对RXRA具有较好的结合能力；5个化合物分子与BCL2蛋白晶体的结合能均小于-10 kcal/mol，但与BCL2特异性配体(ID：1E9)在结合能方面存在一定差距，与NR3C1的结合能也均不理想，表明perlolirine可能对PPARG存在较好的结合能力，并且perlolirine、myricanone与RXRA也能形成较好结合。然后，选取与靶点蛋白晶体结合较好的化合物分子，对其与5个靶点分子的结合情况进行可视化，见图5。

表2 KEGG富集分析

表3 活性化合物与潜在靶点的对接结果

注：A～C分别为perlolirine与RXRA、NR3C1、PPARG蛋白晶体活性口袋的对接模式，D～E分别为perlolirine、wallichilide与BCL2蛋白晶体活性口袋的对接模式，F～G分别为β-stigmasterol、wallichilide与c-Jun蛋白晶体活性口袋的对接模式。图5 活性分子与靶点蛋白晶体活性口袋的分子对接模式Fig.5 Modes of molecular docking between active molecules and active pockets of target protein crystals

3 讨论

“辛润”治燥并非单药专攻，而是治法配伍[16]。当归芍药散中当归、川芎单用时对AD无显著疗效，而合用后表现出显著的协同增效作用[17]。近年来，基因芯片结合生物信息学广泛应用于疾病研究[18]，而网络药理学的整体性及系统性与中医药基本特点相吻合[19]。

JUN、NR3C1、PPARG、RXRA、BCL2、BAX等靶点是整个PPI网络的节点蛋白，可作为治疗AD的潜在靶点。JUN属于AP-1转录因子家族，调节基因的表达[20]，温胆汤改良方能显著性降低NG108-15细胞JNK、c-Jun表达，降低细胞凋亡率[21]；NR3C1主要参与炎症反应、细胞增殖和靶组织分化[22]，而PPARG则主要是负责脂类分解代谢等[23]；RXRA是核配体激活转录因子家族成员[24]，其基因变异可能通过影响脑胆固醇代谢而成为AD的危险因素[25]；BCL2、BAX均属于BCL-2基因家族，前者抗凋亡，后者促凋亡，两者联合调控细胞凋亡进程[26]。但在AD发病机理中，自噬作用及其与细胞凋亡的关系鲜有报道[27]。

KEGG代谢通路显示，当归-川芎药对作用机制主要与神经活性配体-受体相互作用通路、糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、神经营养因子信号通路、细胞凋亡通路、非酒精性脂肪肝通路、PI3K-Akt信号通路等有关，与其作用于AD的信号通路[28-30]基本相符，其中对PI3K-Akt信号通路的研究相对较多[31-32]。此外，非酒精性脂肪肝及糖尿病脑病与AD相关的说法近年来逐渐被关注[33-35]，提示AD可能是一种代谢性疾病[36]。分子对接显示，perlolirine可能对PPARG存在较好的结合能力，并且perlolirine，myricanone与RXRA也能形成结合。前期报道，β-stigmasterol、stigmasterol、myricanone、perlolirine、wallichilide均表现出较好的调节糖脂代谢活性[37-41]，在当归-川芎药对治疗AD中扮演了重要角色。

综上所述，本研究在辛润理论的指导下运用生物信息学、网络药理学来探析当归-川芎药对治疗AD的物质基础及作用机制，发现β-stigmasterol、stigmasterol、myricanone、perlolirine、wallichilide可能发挥了重要作用，同时还得到了核心靶点JUN、NR3C1、PPARG、RXRA、BCL2、BAX等，涉及蛋白结合、细胞、氧化还原过程、神经活性配体-受体相互作用通路、PI3K-Akt信号通路、AGE-RAGE信号通路等多种可能的生物功能和代谢通路，通过调控细胞凋亡、影响神经递质释放、减轻炎症反应、缓解线粒体损伤等多种途径来发挥疗效。