扶正固本颗粒HPLC指纹图谱建立

仝立国， 牛艳艳， 吉海杰， 宋美卿， 杨 钤， 冯玛莉， 汪欣文

(山西省中医药研究院，山西 太原 030012)

扶正固本颗粒由黄芩、淫羊藿、女贞子、何首乌、地黄、茜草等8味中药组成，具有益气养阴、凉血解毒的功效，适用于对食管癌、胃寒气阴两虚兼热毒症患者放化疗时合并用药，收载于国家药品监督管理局标准(WS-5250(B-0250)-2002)[1]，但目前该制剂质量控制方法仍以单一成分为指标，难以全面确保其质量稳定性。

中药指纹图谱具有信息量大、特征性强等特点，能从整体上把握其质量，在评价质量一致性及产品稳定性方面具有明显的优势[2]。前期已有很多对中药药味指纹图谱、含量测定及成分分析的报道[3-10]，本实验在此基础上建立扶正固本颗粒HPLC指纹图谱，以期为后续制定与该制剂功效相关的多成分含量测定方法提供依据，也为建立其系统全面的质量标准奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，配置G1322A真空脱气机、G1311A四元泵、G1329A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315D DAD二极管阵列检测器、HP Chemstation色谱工作站；超高效液相色谱-高分辨质谱系统(美国Waters公司)，包括ACQUITY UPLC I Class-G2-XS QTOF、MassLynx V4.1 质谱工作站、ESI离子源。XS105电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；超纯水器(美国Millipore公司)；S60H超声波清洗机(德国艾尔玛公司)。

1.2 试剂与药物 黄芩苷(110715-201318)、黄芩素(111595-200604)、淫羊藿苷(110737-201516)、宝藿苷I(111852-201603)、汉黄芩素(111514-201706)、汉黄芩苷对照品(112002-201702)，2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯基葡萄糖苷对照品(110844-201109)、大黄素(110756-201512)对照品均购于中国食品药品检定研究院。黄芩、淫羊藿、女贞子、何首乌、地黄、茜草、黄精、人参均由山西振东开元制药有限公司提供，经山西省药品检验所高天爱主任药师鉴定为正品。扶正固本颗粒共10批，均来源于山西振东开元制药有限公司，批号分别为20160603、20161104、20170806、20170401、20171012、20180302、20180601、20181002、20190301、20190603。甲醇、乙腈为色谱纯(迪马科技公司)；其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相甲醇(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～20 min，5%～40%A；20～38 min，40%～50%A；38～62 min，50%A；62～68 min，50%～65%A；68～73 min，65%A；73～80 min，65%～75%A；80～85 min，75%～80%A；85～90 min，80%～90%A；90～98 min，90%A；98～100 min，90%～5%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温25 ℃；检测波长0～9.25 min 275 nm，9.25～10.5 min 285 nm，10.5～12.5 min 260 nm，12.5～14.5 min 250 nm，14.5～24 min 275 nm，24～25.5 min 320 nm，25.5～100 min 275 nm；进样量10 μL。

2.2 质谱条件 参考文献[11]报道。XEVO G2-XS ESI离子源，正/负离子模式；锥孔电压40 V；离子源温度100 ℃；脱溶剂气温度400 ℃；锥孔气体积流量50 L/h；脱溶剂气体积流量700 L/h；扫描范围m/z100～1 500；校正液亮氨酸-脑啡肽，[M+H] 556.277 1，[M-H] 554.261 5。采用Masslynx4.1工作软件，在MSEContinuum模式采集质谱数据，扫描速率0.2/s，碰撞能量20～35 V。

2.3 供试品溶液制备 取本品约2.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL80%甲醇，称定质量，超声(250 W、40 Hz)处理30 min，放冷，80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 对照品溶液制备 精密称取黄芩苷、淫羊藿苷、汉黄芩素、汉黄芩苷、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯基葡萄糖苷、大黄素对照品适量，甲醇溶解，即得。

2.5 单味药材溶液制备 称取黄芩、淫羊藿、何首乌、女贞子、生地黄、茜草、黄精、人参适量，粉碎为粗粉，提取2次，第1次加10倍量水，第2次加8倍量水，每次1 h，合并提取液，浓缩，80 ℃干燥。称取上述提取物适量，按“2.3”项下方法制备，精密吸取2 mL至10 mL量瓶中，80%甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.6 阴性样品溶液制备 分别称取缺黄芩、缺淫羊藿、缺何首乌、缺女贞子、缺生地黄、缺茜草、缺黄精、缺人参阴性样品适量，按“2.3”项下方法制备，精密吸取2 mL至10 mL量瓶中，80%甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.7 方法学考察

2.7.1 精密度试验 取同一批本品(批号20170806)适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定7次，以黄芩苷为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD在0～0.14%范围内，相对峰面积RSD在0～2.83%范围内，表明仪器精密度良好。

2.7.2 重复性试验 取同一批本品(批号20170806)适量，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，以黄芩苷为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD在0～0.08%范围内，相对峰面积RSD在0～2.40%范围内，表明该方法重复性良好。

2.7.3 稳定性试验 取同一批本品(批号20170806)适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，于0、3.5、7、10.5、14、19、24、30、36 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，以黄芩苷为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD在0～0.18%范围内，相对峰面积RSD在0～2.37%范围内，表明溶液在36 h内稳定性良好。

2.7.4 耐用性试验 采用Dimak Diamonsil C18、TIANHE Kromasil C18、ELITE SinaChrom C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，在“2.1”项色谱条件下进样测定，以黄芩苷为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD在0～3.52%范围内，相对峰面积RSD在0～2.33%范围内，表明色谱柱耐用性良好。

2.8 HPLC指纹图谱建立 参考文献[2,12]报道，取10批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，将所得图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012.130723版)，设定S1样品图谱作为参照，采用平均数法，设定时间窗宽度为0.1，经过多点校正后自动匹配，共有36个共有峰，见图1～2。

图1 对照指纹图谱

图2 10批样品HPLC指纹图谱

再取供试品、对照品、单味药材溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，通过保留时间和紫外吸收光谱数据对各共有峰进行归属，在“2.2”项质谱条件下对其进行指认。

3 结果

3.1 相似度评价 10批样品相似度均大于0.99，表明各批之间成分一致，质量稳定。

3.2 共有峰归属及成分分析 图3显示，12号峰为2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯基葡萄糖苷(m/z405.120 8, M-H)，17号峰为黄芩苷(m/z455.091 3, M-H)，23号峰为汉黄芩苷(m/z459.104 9, M-H)，25号峰为黄芩素(m/z269.049 7, M-H)，26号峰淫羊藿苷(m/z721.231 4, M-H)，31号峰为汉黄芩素(m/z283.065 1, M-H)，33号峰为宝藿苷I(m/z513.181 5, M-H)，35号峰为大黄素(m/z269.049 7, M-H)。各单味药材成分与颗粒成分基本对应，其中黄芩、淫羊藿、何首乌、女贞子对共有峰的贡献较大，地黄、人参、茜草、黄精贡献较小，见图4、表1。

图3 各成分质谱图

图4 供试品、单味药材溶液HPLC色谱图

4 讨论

4.1 提取溶剂优化 本实验比较了50%甲醇、80%甲醇、甲醇所制备供试品溶液的指纹图谱，发现50%、80%甲醇对2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯基葡萄糖苷的提取较充分，而3种溶剂对其他成分的提取均无明显差异。由于50%甲醇黏度大于80%甲醇，微孔滤膜过滤时耗费时间较长，故最终确定80%甲醇作为提取溶剂。

4.2 流动相优化 本实验曾采用乙腈-0.1%磷酸进行梯度洗脱，发现结构相似的色谱峰较集中，分离度较差，故最终确定洗脱能力较弱的甲醇作为流动相，取得了较为满意的分离度。

4.3 检测波长优化 本实验采用DAD检测器对供试品溶液中各色谱峰的紫外吸收进行全波长扫描，确定了每个指纹峰最大吸收波长，并采用不同时间改变最大吸收波长的方法进行测定，发现指纹图谱中各指纹峰均能满足分析要求。

表1 各共有峰归属

5 结论

本实验建立了10批扶正固本颗粒的HPLC指纹图谱，确定了36个共有峰，覆盖了方中5味中药主要特征成分，共有峰面积达90%以上，并对2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯基葡萄糖苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、淫羊藿苷、汉黄芩素、宝藿苷I、大黄素进行了指认，能在整体上对该制剂质量进行控制，也为制定规范化、标准化的相关质量控制方法提供实验依据。