基于UPLC法泽泻水提液指纹图谱的建立

罗 山，黄王琛，刘 懿，吕莹莹,李改元，唐文强,2

(1.陕西国际商贸学院 医药学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中药绿色制造技术协同创新中心，陕西 咸阳 712046)

泽泻作为中药材，在我国具有非常悠久的历史，最早出现于《神农本草经》，是泽泻科植物泽泻(Alisma orientale (Sam.) Juzep.)的干燥块茎，具有利水渗湿、泄热化浊的功效[1～2]，产地主要集中在四川、福建、江西和广西等地区。现代临床上主要用于降血脂、降血压、抗炎保肝、利尿、治疗糖尿病和抗肿瘤等[3～6]。

泽泻化学成分复杂，在临床上常作用于多个靶点，很难通过几个特定的成分对其质量进行整体评价[7]。指纹图谱是一种很好的“模糊鉴别”的方式，能够反映药材的整体特征[8～9]。张敏娜等[10]采用气相色谱(GC)，通过控制程序升温的条件和方法学考察，建立了具有18个共有峰的泽泻乙腈提取液的指纹图谱。刘小蔓[11]等采用高效液相色谱法-电喷雾电离质谱技术(UPLC-ICP-MS)，指认了泽泻6个特征峰。陈莹等[12]采用高效液相色谱法(HPLC)，在208 nm和245 nm波长下，分别建立了含有17个和10个共有峰的泽泻乙腈提取液的指纹图谱。樊李明等[13]采用超高液相色谱法(UPLC)，建立了含有14个共有峰的泽泻乙腈提取液的指纹图谱。在众多指纹图谱检测技术中，UPLC法能够对复杂体系实现快速检测，灵敏度高，可以节约分析时间，同时UPLC的检测温度低，不会对被检测物质造成破坏，能够最大限度的客观反应复杂体系的特征。此外，目前报道的关于泽泻指纹图谱的建立，检测的对象均为泽泻乙腈的提取液，但是在实际使用时，一般采用的是泽泻的水提液。不同的提取溶剂势必会造成泽泻提取成分的不同，指纹图谱也会存在差异，但是关于泽泻水提液指纹图谱的研究尚未见报道。因此笔者研究采用UPLC法，对来自四川、福建、广西、江西4个泽泻主要产地不同批号的20批泽泻水提液建立指纹图谱，并指认泽泻醇A、泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇醇B这三个泽泻的关键成分，为提高泽泻饮片质量控制方法提供实验依据

1 实验部分

1.1 主要仪器、试剂与药材

采用美国waters公司生产的ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色谱仪；昆山舒美超声仪器生产的KQ2200DA型数控超声波清洗器；瑞士梅特勒公司生产的Mettler AE240电子分析天平；德国MAYZUN公司生产的TE124S电子分析天平；四川优普生产的UPT-I-10T反渗透超纯水机。

对照品：泽泻醇A(批号：R02N6F5398)、泽泻醇B(批号：M15A7S13161)购自上海源叶生物有限公司；23-乙酰泽泻醇B(批号：F0711AS)，购自大连美仑生物有限公司。乙腈(色谱纯)购自美国天地公司；其它试剂均为分析纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司；实验用水为UPT-I-10T反渗透超纯水机过滤所得。

20批泽泻样品产地分别四川、福建、广西、江西，均购自市售的各大药店，符合2015版《中国药典》标准，样品留存于陕西国际商贸学院中药研究院科研实验室201室。样品信息如下S1(190101)购自亳州市华云中药饮片有限公司(四川)，S2(180401)、S3(180701)、S4(170101)、S5(170701)来自安国祁安药业有限公司(四川)，S6(170701)来自四川省天府神龙中药饮片有限公司(四川)，S7(20180801)购自陕西兴盛德药业有限责任公司(福建)，S8(160908031)、S9(160800471)、S10(160904381)购自康美药业股份有限公司(福建)，S11(171001)、S12(171003)、S13(171204)来自福建承天药业有限公司(福建)，S14(180401)、S15(180404)、S16(180407)、S17(180409)购自广西，S18(P201605118)购自江西宏洁中药饮片有限公司(江西)、S19(1612011)购自江西樟树天齐堂中药饮片有限公司(江西)、S20(20170101)购自江西青春康康源中药饮片有限公司(江西)。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的制备 精确称取0.0037 g泽泻醇A，0.0035 g泽泻醇B和0.0024g乙酰泽泻醇B-23分别加入到5mL容量瓶中，加入适量甲醇完全溶解，然后用甲醇定容得单组分对照品溶液；精确量取上述各单组分溶液1 mL，加入到5 mL容量瓶中，用甲醇定容得混合对照品溶液。

1.2.2 泽泻水提液供试品制备 称取泽泻80 g，加水200 mL，浸泡30 min，先大火至沸腾，再小火煎煮2 h，纱布过滤，冷却，离心，取上清液即得供试品溶液。

1.2.3 色谱条件 ACQUITYUPLC BEH C18(2.1×50 mm，1.7 μm )色谱柱；流动相为乙腈( A) -水( B) ；梯度洗脱条件：0～4 min，5%～55%A；4～6 min，55%～70%A；6～10 min，70%～90%A；10～14 min，90%～5%A；14～15 min，5%～5%A；流 速 0.3 m L·min-1；柱温35 ℃；全波长扫描(190～400 nm) ；进样量 10 μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

在190～400 nm范围内，采用3D通道，对泽泻水提液进行全波长扫描测试，结果表明208 nm为最佳测试波长，在208 nm下基线平稳，共有峰数量多，且分离度符合检测要求，部分峰具有较高响应值，因此选择208 nm作为泽泻水提液后续检测波长。泽泻主要化学成分为三萜类、二萜类、倍半萜类类等化合物[21～22]，采用乙腈-水溶液作为流动相进行泽泻水提液的UPLC检测，基线平稳，色谱峰峰形好，各化合物之间分离度高。因此选择乙腈-水作为流动相，并采用梯度洗脱的方法对泽泻水提液进行分析。当柱温为35℃C时，泽泻水提液的UPLC谱图分离效果最好，因此确定柱温为35 ℃。

2.2 泽泻水提液指纹图谱的建立

2.2.1 精密度实验 精密吸取S1 批泽泻水提液供试品溶液，按“1.2.3”项色谱条件，连续进样 6 次，记录谱图。以14号峰泽泻醇B为参照峰，各特征共有峰相对保留时间的RSD均小于 1% ，相对峰面积的RSD均小于4.88%，表明所用仪器精密度良好，符合指纹图谱的技术要求。

2.2.2 重复性实验 取S1批泽泻水提液供试品溶液6 份，按“1.2.3”项色谱条件依次进样，记录谱图。以14号峰泽泻醇B为参照峰，各特征共有峰相对保留时间的RSD均小于 1%，相对峰面积的RSD均小于 4.45%，表明本方法重复性良好，符合指纹图谱的技术要求。

2.2.3 稳定性实验 取S1批泽泻水提液供试品溶液，按“1.2.3”项所述的色谱条件，分别在0，4，8，12，16，24 h 测定UPLC色谱图，以14号峰泽泻醇B为参照峰。结果显示，各特征共有峰相对保留时间的RSD 均小于 1% ，相对峰面积的RSD均小于 4.84%，表明供试品溶液在 24 h内稳定性良好。

2.2.4 专属性考察 按照“1.2.3”项所述的色谱条件进样溶剂甲醇，得溶剂甲醇的空白 UPLC 色谱图，结果见图1，由图1可见空白溶剂甲醇中没有明显的色谱峰，表明溶剂甲醇不会对泽泻水提液的色谱图产生干扰，所有的色谱峰均来自于泽泻水提液。

图1 空白溶剂甲醇的UPLC色谱

2.2.5 标准对照品UPLC色谱图的测定 按照1.2.3色谱条件分别进样泽泻醇A，泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B以及混合对照品溶液得对照品UPLC色谱图，结果见图2。

图2 对照品的UPLC色谱(1:泽泻醇A;2:泽泻醇B;3:23-乙酰泽泻醇B)

由图2可见，泽泻醇A的保留时间为8.892 min，泽泻醇B的保留时间为10.804 min，23-乙酰泽泻醇B的保留时间为11.956 min，三个对照品的分离度高，峰型好，无拖尾现象。

2.2.6 指纹图谱建立 按“1.2.2”项方法制备20 批泽泻水提液供试品溶液，采用1.2.3色谱条件进行测定，记录色谱图，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统生成指纹图谱，见图3。

(1)参照峰的选择。对比20 批供试品指纹图谱和标准品对照谱图，可确定14号峰为泽泻醇B，其峰与其它物质的分离度高，峰型好且稳定，故确定14号泽泻醇B色谱峰为参照峰。

(2)共有峰标定。由图3可见，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统处理，20批泽泻水提液共有19个共有峰(见图3 A)，分别为1号峰(4.717 min)，2号峰(5.642 min)，3号峰(6.684 min)，4号峰(7.0334 min)，5号峰(7.239 min)，6号峰(7.884 min)，7号峰(8.254 min)，8号峰(8.460)，9号峰(8.665)，10号峰(8.891)，11号峰(9.241)，12号峰(9.488)，13号峰(10.441)，14号峰(10.801)，15号峰(11.951)，16号峰(12.223)，17号峰(12.6211)，18号峰(12.2772)，19号峰(13.7930)，其中10号峰为泽泻醇A，14号峰为泽泻醇B，15号峰为23-乙酰泽泻醇B，这3个色谱峰的分离度高，分型好，而且稳定，能够作为泽泻水提液质量控制的指标性成分。

图3 泽泻水提液UPLC色谱(A)和20批泽泻水提液指纹图谱(B)

(3)相似度评价。利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2004A 版软件计算分析，20批泽泻供试品色谱图中特征共有峰的相对保留时间的RSD 均小于1%，相对峰面积的 RSD均小于 5% ，色谱图相似度大于0.924(见表1)，表明批次间存在差异，但差异性较小，制备工艺稳定，方法准确可靠。

表1 20批泽泻水提液与对照指纹图谱的相似度

3 结论

实验采用超高液相色谱法对20批泽泻水提液进行了分析，建立了泽泻水提液的指纹图谱，共标定了19个共有峰，同时指认了泽泻醇A，泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇B三个泽泻主要化学成分的色谱峰，建议这3个成分为可作为泽泻水提液质量控制的指标性成分。不同产地不同批号泽泻水提液之间存在一定的差异，但差异性较小。该方法快速、准确，重复性高，稳定性好，特征性强，能够为提高泽泻水提液的质量控制提供参考。