环孢素（微乳型）滴眼液抑菌剂抑菌效力研究

杨熠倩，马一平

（天津市眼科医院，天津 300020）

环孢素滴眼液的适应证以结膜干燥综合症为主，同时对眼角膜移植术（OOKP）术后免疫排斥具有效防治作用，疗效显著［1］。为满足临床不同需要，本院自制环孢素（微乳型）滴眼液，而滴眼液尤其是多效量滴眼液，若其缺乏充分抗菌效能，一定要添加抑菌剂来抑制滴眼液存放与应用期间沾染的微生物。现今临床应用的多数滴眼液皆加入了抑菌剂，最常用到的为羟苯酯类：羟苯甲酯（methylparaben）、羟苯乙酯（ethylparoben）、羟苯丙酯（propylparaben）和羟苯丁酯（butylparaben），其中羟苯乙酯对角膜结膜的毒性最小，并且对细菌、真菌的抑菌效能都很强，在对抑菌剂进行选择方面，因同时具备抑菌功能与毒性效应，故需格外重视其于制剂内的处方量，所以应保证所选抑菌剂于滴眼液有效期内具备充分抑菌性能，由此检测抑菌剂的抑菌效力，找到适宜比例的抑菌剂用量。本文依照《中国药典》中抑菌剂效力检查法指导原则针对添加0.10%、0.07%和0.05%羟苯乙酯的环孢素滴眼剂的抑菌效力进行考查，分析其抑菌剂加入的科学性［2］。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高压蒸汽灭菌器（日本Hirayama仪器制造公司）；1300 Series A2型二级型生物安全柜（Thermo Fisher Scientific公司）；MJ－150－112真菌培养箱（上海一恒科技有限公司）；KB115型恒温培养箱（德国Binder公司）。

1.2 菌种 此项研究中，所涉及菌株的传代次数应控制为≤5代（取自菌种存储中心的干燥冷冻菌种是第0代）。借助适当的菌种存储技术来存储试验用菌种，从而对实验菌株的生物学性能起到有效保障。大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］，皆取自中国食品药品检定研究院，在菌株传代数方面，皆是第3代［3］。

1.3 培养基及稀释剂 沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、胰酪胨大豆琼脂培养基（STA）、氯化钠（NaCl）-蛋白胨缓冲溶液、0.9%灭菌NaCl溶液（内含0.05%聚山梨酯80），上述各试剂皆由中国药品生物制品检定所提供，同时基于2020年版《中国药典》所示配制、灭菌，所用方法为高压蒸气灭菌法，最后分装。

1.4 供试品 环孢素（微乳型）滴眼液（批号20200420），由天津市眼科医院制剂室生产。

2 试验方法

2.1 菌液的制备 向胰酪胨大豆琼脂培养基（STA）或胰酪胨大豆肉汤培养基（TSB）内接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的新鲜培养物，于35℃进行24 h培养，再添加适量的无菌NaCl溶液（0.9%），洗脱处理琼脂表面的培养物，然后将菌悬液吸入到灭菌试管中，添加适量无菌NaCl溶液（0.9%），同时借助比浊法，完成菌悬液（菌含量为108cfu/ml）的制备［4］。

向沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）或 沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）内接种白色念珠菌，于25℃进行48 h培养。通过适量灭菌NaCl溶液（0.9%）洗脱处理琼脂表面的培养物，然后将菌悬液吸入到灭菌试管里，再加入适量灭菌NaCl溶液（0.9%），同时借助比浊法，完成菌悬液（菌含量为108cfu/ml）的制备。

向沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）斜面上接种黑曲霉的新鲜培养物，置于25℃进行7 d培养，再添加5 ml的0.9%灭菌NaCl溶液（内含0.05%聚山梨酯80），洗脱处理孢子。然后将孢子悬液吸入到灭菌试管里，通过0.9%灭菌NaCl溶液（内含0.05%聚山梨酯80）完成孢子悬液（孢子含量为50~100 cfu/ml）的制备。并借助平皿法，对1 ml菌悬液的菌量展开测定［5］。

将已完成配制的菌悬液移至室温中，放置时间不得超过2 h，如果存放温度为2~8℃，那么存放时间不得超过1 d。可将黑曲霉孢子悬液存放于2~8℃温度条件下，应保证于已证实的贮存期内应用。

2.2 培养基的适用性检查 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌各100 cfu，并分别向灭菌平皿内转移，随即马上倾注胰酪胨大豆琼脂培养基，每株试验菌皆安排2个平皿的平行制备，充分混合，凝固，再移至35℃环境中，培养2 d，计数，取白色念珠菌、黑曲霉菌皆100 cfu，移至灭菌平皿内，马上倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌皆安排2个平皿的平行制备，充分混合，凝固，再移至25℃环境中培养3 d，计数。此外，通过相应对照培养基取代被检培养基开展以上试验，结果见表1。由此发现，被检培养基上的平均菌落量≥对照培养基上70%的平均菌落量，同时在菌落形态大小上，双方相当，可见被检培养基具备适用性［6］。

表1 适用性试验结果

2.3 供试品接种 抑菌剂效力与试验用容器特征（诸如体积、形状、材质与封口形式等）可能存在联系。所以，当供试品各包装容器装量可充分满足试验用，且容器便于完成试验菌液、取样、混合等无菌操作时，通常直接向供试品原包装容器内种植试验菌。向无菌容器内放置供试品时，应包装此容器材质对供试品诸如吸附性等特性不产生影响，尤其需防止对供试品酸碱度产生影响，酸碱度可在较大程度上影响抑菌剂活性，并且容器口径大小需方便供试品混匀与进出操作。

取包装完整的供试品5份，每份供试品为2 ml的环孢素（微乳型）滴眼液，分别将含菌量为106cfu/ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、大肠埃希菌和黑曲霉菌各20 μl接种于5个供试品中，彻底混合，保证试验菌均匀分布于供试品内［7］，在试验过程中，应将供试品放置于25℃遮光存放，存放温度波动需尽量最小化，同时避免污染的发生。

2.4 培养和计数 除了特定要求，在培养时间上，酵母菌与霉菌为120 h，即5 d；细菌为72 h，即3 d。逐日查看菌落生长状况；对菌落量进行统计。如有必要，应妥善增加培养时间到7 d，再统计菌落量，同时报告。对于平板上显示片状生长状态的菌落，无需统计。待完成菌落数的点计，对各稀释级供试液的菌落量均值展开求解，基于菌量报告规则报告菌量。如果同稀释级2个平皿的平均菌落量≥15，那么2个平皿的菌落量相差倍数应低于1倍［8］。

胰酪胨大豆琼脂培养基用于细菌计数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌与霉菌计数；酵母菌计数还可应用YPD（酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基）。当面对特殊状况，如果胰酪胨大豆琼脂培养基上有酵母菌与霉菌生长，沙氏葡萄糖琼脂培养基上有细菌生长，那么需各自点计酵母菌与霉菌、细菌菌落量。再将胰酪胨大豆琼脂培养基上的酵母菌与霉菌或沙氏葡萄糖琼脂培养基上的细菌量，与沙氏葡萄糖琼脂培养基内的酵母菌与霉菌或胰酪胨大豆琼脂培养基内的细菌量展开对比，将菌落量多的培养基内的菌量当做计数结果［9］。

2.5 菌数报告规则 霉菌最好选择菌落数均值＜100 cfu、酵母菌与细菌的最好选取菌落数均值＜300 cfu的稀释级，当做菌数报告（有效数字应取2位）的依据。通过最多的菌落数均值与稀释倍数相乘所得值，对10 cm2、1 g或1 ml供试品内所含菌量进行报告。

倘若不同稀释级的平板皆未长有菌落，或只最小稀释级的平板长有菌落，但菌落数均值＜1时，通过小于1与最小稀释倍数相乘所得值对菌数做出报告。

基于菌数测量结果，求解1 ml（g）供试品各被测菌加入量，还有不同间隔时间的菌量，同时完成向lg值的换算［10］。

2.6 设计试验条件 平行操作以下3组含有不同浓度抑菌剂的环孢素滴眼液：A组含0.10%的羟苯乙酯，B组含0.07%的羟苯乙酯，C组含0.05%的羟苯乙酯，装量均为10 ml，分别接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉孢子悬液，同上述方法加菌液分别在6 h、24 h、7 d、14 d和28 d各个时间点进行测试［11］。

2.7 抑菌效力评价标准 环孢素滴眼液抑菌效力评价标准按照《中国药典》2020年版四部通则1121“抑菌效力检查法”中眼用制剂的抑菌效力判断标准。该判断标准分为A、B两个标准，“A”所指为应实现的抑菌效力标准，若遇特殊状况，如抑菌剂和AR风险增大可能相关，那么应满足“B”的抑菌效力条件［12］，见表2。

表2 《中国药典》2020年版眼用制剂抑菌效力判断标准

3 结果

参照《中国药典》2020年版四部通则1121抑菌效力检查法对眼用制剂抑菌效力进行判断。试验结果显示，对于真菌与细菌，A组、B组皆表现较强的抑制效能。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌以及黑曲霉在抑菌剂浓度上调的情况下皆显示大幅降低表现，皆可实现“A”抑菌效力标准，同2020年版《中国药典》所示判断标准相符，均符合规定。C组真菌抑菌效力能达到“A”，细菌抑菌效力在“B”上，据文献报道羟苯乙酯是比较安全优良的抑菌剂未报道有增加不良反应的风险规定特殊情况下，如抑菌剂和AR发生率提高可能相关，那么最低应满足“B”的抑菌效力条件，所以C组只能作为最低有效浓度，据文献报道，抑菌剂在样品储存过程中，会随时间逐渐增加抑菌性逐渐减弱，所以不会首选C组。故应选择B组的浓度作为环孢素滴眼液的处方浓度［13］。见表3。

表3 环孢素（微乳型）滴眼液抑菌效力试验结果

4 讨论

倘若药物缺乏充分的抗菌功能，那么需基于制剂特性（诸如水制剂）加入适当的抑菌剂，从而避免正常存放以及应用期间制剂可能出现微生物污染与滋生现象，特别是多剂量包装的制剂，防止受到药物微生物变质与污染影响，伤及病人［14］。向环孢素（微乳型）滴眼液内加入的抑菌剂是羟苯乙酯，此物质具备良好稳定性，不管是酸性介质，还是碱性介质，皆具有效性，可在较强程度上抑制霉菌，同时对铜绿假单胞菌存在良好的抑菌防腐表现，使得滴眼液质量得到有效保障。并且其对角膜结膜的毒性最小。然而用量不足，达不到有效抑菌浓度，用量过大又易引起不良反应，此外，诸多因素皆与抑菌剂的抑菌效力相关，影响抑菌剂有效性的因素为溶液的pH、容器及包装等。因此对药物中所加抑菌剂的抑菌效力进行测定非常重要。此次研究借鉴2020年版《中国药典》所示环孢素（微乳型）滴眼液内羟苯乙酯抑菌剂3个浓度水平开展效力测定，确定最佳浓度，对医疗机构更为有效地控制制剂质量有着积极作用。