HPLC双波长法测定荜铃胃痛颗粒中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量

耿冶飞，陈秀杰，龚亚飞，娄 靖

（鹤壁市食品药品检验检测中心，河南 458030）

荜铃胃痛颗粒由荜澄茄、延胡索（醋制）、大黄（酒制）、黄连、吴茱萸等药材组成，具有行气活血、和胃止痛的功效。临床上主要用于气滞血瘀引起的胃脘痛，以及慢性胃炎见有上述症状者。现执行标准《中国药典》2020年版一部仅有对盐酸小檗碱的含量测定，以及延胡索、大黄、黄连、吴茱萸、荜澄茄的薄层色谱定性鉴别。中药吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang或疏毛吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果实。具有散寒止痛、降逆止呕和助阳止泻的功效［1］，吴茱萸作为臣药在制剂中发挥温中止痛、疏肝下气的功效，目前关于吴茱萸质量控制方面的研究多集中在吲哚喹啉类生物碱（如吴茱萸碱和吴茱萸次碱）的含量测定［2］，吴茱萸碱和吴茱萸次碱作为吴茱萸的主要活性成分，其含量将直接影响该制剂的质量，本试验通过高效液相色谱法测定制剂中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量，并对其进行系统的方法学验证，可以更加有效地控制荜铃胃痛颗粒的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器Waters Acquity Arc高效液相色谱仪，Waters 2998 PDA检测器（美国沃特世科技有限公司）；METTLER TOLEDO XA105DU电子分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；Elmasonic P300H超声波清洗机（德国艾尔玛公司）；Milli-Q超纯水机（美国密理博公司）。

1.2 试药 吴茱萸碱对照品（批号110802-201710，供含量测定用，含量以99.6%计）及吴茱萸次碱对照品（批号110801-201608，供含量测定用，含量以99.7%计）均购自中国食品药品检定研究院。甲醇（美国霍尼韦尔公司，色谱纯）、乙腈（美国霍尼韦尔公司，色谱纯）、无水乙醇（天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯）、磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司，优级纯），水为超纯水。荜铃胃痛颗粒来自扬子江药业集团江苏制药股份有限公司，批号分别为20092824、20092622、19121421。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱Ultimate AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（38∶62），柱温：30℃，流速为1.0 ml/min，检测波长：吴茱萸碱226 nm，吴茱萸次碱342 nm，进样量为20 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取吴茱萸碱对照品16.80 mg，置于100 ml量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，制成浓度为0.167 3 mg/ml的储备液；精密称取吴茱萸次碱对照品11.52 mg，置于100 ml量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，制成浓度为0.114 9 mg/ml的储备液。分别精密吸取吴茱萸碱和吴茱萸次碱储备液10 ml，置于同一50 ml量瓶中，加70%乙醇稀释并定容至刻度，制成含吴茱萸碱33.48 μg/ml和吴茱萸次碱22.97 μg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下的内容物，研细，取5.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理（380 W，37 KHz）40 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按照荜铃胃痛颗粒质量标准［1］项下处方制备不含吴茱萸药材的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制成阴性样品溶液。

2.3 专属性试验 分别取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各20 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果显示，吴茱萸碱与吴茱萸次碱色谱峰峰形对称，色谱峰分离度均大于1.5，理论塔板数均大于10 000，阴性样品溶液在与供试品溶液中吴茱萸碱和吴茱萸次碱相同保留时间处无干扰峰出现，表明该方法专属性良好。见图1。

2.4 线性关系试验 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液2、4、8、12、16和20 μl，按“2.1”项下色谱条件分别注入液相色谱仪，以峰面积为纵坐标（Y），以进样量（ng）为横坐标（X）绘制标准曲线，结果见表1。

2.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液20 μl，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定2个成分的色谱峰峰面积，结果吴茱萸碱和吴茱萸次碱色谱峰面积RSD（n=6）分别为0.82%和0.73%，表明精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品（批号20092824）溶液20 μl，按“2.1”项下色谱条件分别在0、4、8、12、16和24 h进样测定吴茱萸碱和吴茱萸次碱的峰面积，RSD（n=6）分别为0.40%和0.95%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验 取同一批次供试品（批号20092824）6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样20 μl，记录吴茱萸碱和吴茱萸次碱的色谱峰面积，采用外标法分别计算2种成分的含量，结果吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量的RSD（n=6）分别为0.92%和1.03%，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取已知2个成分含量（分别含吴茱萸碱66.41 μg/g、吴茱萸次碱49.97 μg/g）的样品（批号20092824）6份，每份2.5 g，精密称定，分别加入对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量，计算回收率。结果吴茱萸碱和吴茱萸次碱的平均回收率分别为96.39%和95.83%，RSD分别为1.10%和1.33%。见表2和表3。

表3 吴茱萸次碱加样回收率试验结果

2.9 样品的测定 取3批样品进行测定，按外标法计算吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果（n=6） μg/g

3 讨论

3.1 流动相的选择 结合文献，分别选用甲醇-水、乙腈-水［3-4］、乙腈-0.02%磷酸溶液［1］、乙腈-0.1%磷酸溶液［2］、乙腈-0.2%磷酸溶液［5］作为流动相，当选用甲醇-水和乙腈-水系统作为流动相时，吴茱萸碱与吴茱萸次碱色谱峰出现不同程度的拖尾现象，且分离度不太理想，当改用乙腈-磷酸溶液时，吴茱萸碱与吴茱萸次碱的峰形有所改善，试验发现在乙腈-0.1%磷酸（38∶62）时，吴茱萸碱和吴茱萸次碱色谱峰分离效果较好，能够和其他杂质峰达到基线分离，色谱峰对称性好且出峰时间适中，故选用乙腈-0.1%磷酸溶液作为本试验的流动相。

3.2 提取溶剂的选择 吴茱萸碱和吴茱萸次碱几乎不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂，结合文献，本试验分别选用甲醇［4，6］、无水乙醇［3，7-8］、80%乙醇［5，9-10］、70%乙醇［1-2，11］作为提取溶剂，当采用甲醇、无水乙醇为溶剂进行提取时，发现杂质也随之提取出来，干扰目标峰的分离，当选用80%乙醇和70%乙醇作为提取溶剂时，可以有效规避杂质峰的干扰，并且发现70%乙醇的提取效率稍优于80%乙醇，结合前人试验研究［11］，采用超声提取法可以使提取时间大大缩短，具有更高的提取效率和试验便捷性，故采用超声提取法，以70%乙醇为提取溶剂。

3.3 检测波长的选择 结合文献，吴茱萸碱和吴茱萸次碱的检测波长多设置为215［1］、225［4-6，8-10］、250［3］和326 nm［2］，本试验在190~400 nm波长下对吴茱萸碱和吴茱萸次碱进行扫描，发现吴茱萸碱的最大吸收波长为226 nm，在230 nm之后吸收呈陡降趋势，在300 nm之后几乎无吸收响应，吴茱萸次碱的最大吸收波长为342 nm，在215 nm有较大吸收，在220 nm之后呈下降趋势，在330~350 nm为强吸收区。试验发现，分别在226 nm（吴茱萸碱）和342 nm（吴茱萸次碱）波长下，吴茱萸碱和吴茱萸次碱响应值均较高，且无杂质峰干扰，故采用双波长法分别对吴茱萸碱和吴茱萸次碱进行检测。

通过系统的方法学验证试验，表明该含量测定方法的专属性强、操作简单，方法准确稳定，可以为该制剂的质量控制提供参考。