MicroRNA-150通过下调MUC4抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭*

玛依努尔·尼牙孜,伊力努尔·哈力甫,王 琳,韩莉莉,鲁 静,阿依米热·艾山江,朱开春

(新疆维吾尔自治区人民医院,乌鲁木齐 830001)

宫颈癌是全球女性中第二大常见癌症，是发展中国家女性癌症死亡的主要原因[1]。高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)持续感染是宫颈癌发生的主要危险因素[2]，但病毒介导的癌变机制尚未完全了解[3]。microRNA(miRNA)作为细胞增殖、分化、发育、凋亡和宿主-病毒相互作用等各种过程的重要调节因子[4-5]，其发挥作用的调节机制与许多癌症有关，包括与HPV感染相关的癌症。研究表明，HPV E6和E7癌基因表达参与调控并破坏细胞miRNA表达，许多细胞转录因子包括NF-κB、pRb和p53等已被确定可调节miRNA的转录[6]。miRNA(miR)-150位于染色体19q13，在大量癌症，如白血病和结直肠癌中作为原发肿瘤miRNA发挥作用[7]，可通过促进肿瘤的发生和侵袭作为癌基因，或通过抑制肿瘤生长和转移作为肿瘤抑制因子[8]。研究证明，miR-150异常表达和失调与各种类型的血液系统恶性肿瘤和实体瘤密切相关[9-10]。Abdelhalim等[9]通过对急性髓系白血病患者进行miR-150表达谱分析，表明miR-150在抑制细胞转化中起到肿瘤抑制作用，并且减缓白血病病情发展。Tian等[11]证明p53上调凋亡调控因子(PUMA)可作为miR-150的潜在靶基因，表现为miR-150抑制PUMA从而诱导炎症和β细胞凋亡，而NF-κB通过与miR-150启动子结合激活miR-150表达，从而防止炎症和β细胞凋亡。Fa等[12]通过对甲状腺乳头状癌分析，证明黏蛋白4(MUC4)是miR-150的直接靶标，miRNA介导的MUC4下调与伴随的人表皮生长因子受体2及其磷酸化形成的减少有关，从而抑制下游信号的激活。研究表明，miRNA可作为肿瘤抑制基因或致癌基因，并且相同的miRNA可在不同肿瘤类型中发挥相反的作用[13]。因此，miR-150表达谱及其在宫颈癌中的直接靶点仍难以捉摸。本研究旨在探讨microRNA-150(miR-150)与宫颈癌细胞生物学功能的相关性。

1 材料与方法

1.1 资料来源 收集2017年1月至2018年12月新疆维吾尔自治区人民医院妇科收治的23例宫颈癌患者的癌组织及癌旁组织样本。患者HPV16/HPV18阳性，平均年龄(52.00±11.91)岁，其中维吾尔族17例，汉族6例。收集正常宫颈上皮脱落细胞(cervical exfoliated cells，CEC)样本10例。本研究经医院伦理委员会审查和批准。宫颈癌细胞系SiHa(HPV16)及HeLa(HPV18)购自ATCC，并进行STR验证。细胞培养使用10%胎牛血清、1%双抗、2mmol/L谷氨酰胺的DMEM完全培养基，于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞转染 miR-150 mimics(5'-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3')及miR mimics阴性对照(mimics-NC)(5'-CCGAAACCUCGGUUGAUUGCGG-3')购自上海生工。根据说明书，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,11668019)进行SiHa细胞及HeLa细胞转染。置37℃、5% CO2饱和湿度培养箱培养48h用于进一步分析。

1.2.2 MTT法检测细胞活力 将SiHa及HeLa细胞按5×104/孔接种于96孔板，培养24、48h和72h。每孔加10μL MTT(5mg/mL)，37℃孵育4h。取出弃上清，加二甲基亚砜(150μL/孔)，37℃下溶解甲臜晶体30min。使用Multiskan FC酶标仪(Thermo fisher,USA)于450nm波长处测量吸光度值。

1.2.3 细胞侵袭实验 将SiHa及HeLa细胞按5×105细胞/mL接种至Transwell培养板上室，下室中加含10% FBS的RPMI-1640培养基。孵育24h，用棉签去除上室中未迁移细胞，滤膜下侧的迁移细胞室温下用100%甲醇固定15min，0.1%结晶紫染色。倒置显微镜下对迁移细胞进行计数。

1.2.4 RT-qPCR TRIzol试剂(ThermoFisher,Invitrogen,15596026)提取组织及细胞总RNA。按PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒(Takara,RR037A)步骤，将提取的RNA样品反转录合成cDNA。Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(Takara,638315)试剂盒检测miR-150表达，U6为内参基因。SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(Takara Biotechnology,Co.,Ltd.)检测MUC4 mRNA表达，GAPDH(NM_001256799.3)为内参基因。qPCR引物购自上海生工(表1)。按95℃ 5min，1个循环；95℃ 15s，60℃ 30s，40个循环设置荧光定量PCR仪(AGS，AFD4800)，2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。进行3次实验重复。

表1 引物信息

1.2.5 Western blot 用RIPA裂解缓冲液(Biosharp,BL504A)提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒(biosharp,BL521A)定量总蛋白(40μg/泳道)，配制10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离胶，4%SDS-PAGE浓缩胶，上样进行SDS-PAGE。将蛋白转移到硝酸纤维素膜(PVDF)，置于5%BSA(biofroxx,4240GR025)室温封闭2h，与一抗MUC4(1∶1000,ab60720,Abcam)、GAPDH(1∶1000.ab8245,Abcam)4℃孵育过夜。TBST洗涤膜3次，每次5min；将PVDF膜放入二抗稀释液(1∶10,000,ab191866,ab218695,Abcam)，37℃水浴摇床避光孵育1h，TBST洗涤膜3次，每次5min。将ECL化学发光显色试剂(Solarbio，PE0010)A液和B液1∶1混合均匀，均匀涂在目的条带附近，在暗室中压片曝光显影。Image J软件(V1.52s，Bharti Airtel Ltd)对胶片进行灰度扫描。

1.2.6 使用吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)染色的落射荧光显微镜检测细胞自噬 miR-150 mimics转染后48h收获SiHa和HeLa细胞，并用5μg/mL AO及PI染料染色。使用ZISS ScopeA1荧光倒置显微镜在20×、40×物镜下通过FITC/TRITC通道观察并分析样品。

1.2.7 生物信息学预测和双荧光素酶报告基因检测 使miRNA靶基因数据库Targetscan(www.targetscan.org/vert_71)和miRbase(https://www.mirbase.org/)预测miR-150的假定靶基因。为了研究miR-150对MUC4表达的直接影响，使用含MUC4 3'-UTR区域的pEZX-MT01靶标报告质粒(GeneCopoeia,Inc.,Rockville,MD,USA)。使用QuickchangeII定点突变试剂盒(200521,Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA,USA)在野生型MUC4 3'-UTR (WT)中miR-150的预测靶位点进行定点诱变，生成MUC4 3'-UTR突变(MUT-MUC4 3' UTR)报告基因质粒。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,11668019)在96孔板中将报告基因质粒与miR-150 mimics或mimics-NC共转染到细胞中。转染后48h使用酶标仪检测荧光素酶活性。

2 结 果

2.1 宫颈癌中miR-150及MUC4表达 RT-qPCR检测结果显示，与匹配的癌旁组织相比，宫颈癌组织中miR-150相对表达量显著降低、MUC4相对表达量显著增高(P<0.01)(图1A、B)；与正常宫颈上皮细胞系比较，SiHa、HeLa细胞中miR-150相对表达量显著降低(P<0.01)，MUC4相对表达量显著增高(P<0.01)(图1C、D)。Western blot检测结果显示，宫颈癌组织中MUC4蛋白表达量显著高于癌旁组织(P<0.01)(图1E、F)。

2.2 miR-150 mimics转染后抑制宫颈癌细胞的增殖及侵袭 miR-150 mimics转染后，SiHa细胞及HeLa细胞中miR-150表达量均显著高于mimics-NC组(P<0.05)；miR-150 mimics转染后48、72h，SiHa、HeLa细胞增殖显著抑制(P<0.05)，转染后72h细胞侵袭显著抑制(P<0.05),见图2。

2.3 miR-150 mimics转染后增加宫颈癌细胞的自噬 转染后48h，收集宫颈癌细胞，AO及PI染色后荧光倒置显微镜观察自噬情况并拍照。结果显示，mimics-NC组细胞中主要为绿色荧光，细胞质和细胞核成分中的红色荧光极少，提示基本上无自噬发生；miR-150 mimics组细胞显示大量红色荧光，表明形成了大量酸性自噬溶酶体液泡并诱导了早期细胞凋亡。同时，SiHa细胞及HeLa细胞呈现出典型的早期凋亡细胞形态，细胞核破碎，核膜受损。见图3。

图1 宫颈癌组织及细胞中miR-150及MUC4的表达

图2 miR-150 mimics转染后SiHa及HeLa细胞的增殖与侵袭

图3 miR-150 mimics转染后SiHa及HeLa细胞吖啶橙(AO)染色观察细胞自噬

2.4 MUC4是miR-150的直接靶标 Targetscan和miRbase数据库生物信息学分析预测结果示，MUC4为miR-150的潜在靶点，在MUC4 3'-UTR中鉴定了miR-150的假定结合位点。双荧光素酶报告基因检测验证miR-150是否介导MUC4表达。MUC4 mRNA的3'-UTR，包括推定的miR-150结合序列(WT 3'-UTR)或突变序列(MUT 3'-UTR)，被亚克隆到荧光素酶报告质粒中。与MUC4 WT共转染的SiHa及HeLa细胞中，过表达miR-150导致荧光素酶活性显著降低(P<0.01)，而在与MUC4 MUT共转染的SiHa及HeLa细胞中未降低。表明MUC4是miR-150的直接靶标。miR-150 mimics组SiHa及HeLa细胞中MUC4 mRNA和蛋白表达均显著低于mimics-NC组(P<0.01)。见图4。

图4 双荧光素酶报告基因检测MUC4是miR-150的直接靶标

3 讨 论

大量研究证明，miRNAs通过与靶mRNA的3'-UTR结合，在肿瘤发生和进展过程中作为基因表达的转录调节因子发挥着重要作用[14-16]。失调的miRNA参与调控肿瘤的多种生理过程，包括细胞增殖、药物抗性、细胞凋亡、转移和血管生成[17-18]。目前针对miRNAs的研究集中于癌症特异性miRNA和相关靶基因，以期阐明癌症发生的生物学机制[19-20]。miR-150是一种癌症相关的miRNA，在各种癌症中异常表达[21-22]。Zhang等[23]报道，miR-150在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中上调并且与存活显著相关，并且miR-150表达增加促进了NSCLC细胞的增殖和迁移。Chen等[24]验证了过表达miR-150-5p在体外/体内均抑制了结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和血管生成，而下调miR-150-5p在体外促进了结直肠癌的进展。本研究证实，与正常组织相比，宫颈癌组织中miR-150表达显著下调，转染miR-150类似物至宫颈癌细胞(SiHa/HeLa)后，宫颈癌细胞的增殖速度显著降低，宫颈癌细胞形成了大量酸性自噬溶酶体液泡并出现了早期细胞凋亡现象，即细胞核破碎，核膜受损，这提示miR-150可抑制细胞增殖并增加宫颈癌细胞的自噬及凋亡。这些结果表明，miR-150可能在宫颈癌中发挥着肿瘤抑制的作用，进一步分析miR-150的靶位点以确定miR-150在宫颈癌发生发展中潜在的分子机制。

生物信息学分析预测MUC4为miR-150的潜在靶标。MUC4是一种高分子量的I型跨膜蛋白，在多种癌症中异常表达，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌和膀胱癌，并且在功能上与肿瘤的发生、转移和肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互作用有关[25]。MUC4在胰腺癌中过度表达，并有助于胰腺癌的侵袭性和转移[26-27]。MUC4还在卵巢癌中过度表达并促进卵巢癌细胞的病理生物学和侵袭性[28]。MUC4在肿瘤发生过程中的肠细胞增殖中也起着关键作用[29]。Rowson-Hodel等[30]研究表明，异常表达的MUC4可导致增加乳腺癌的转移效率。这些结果表明，根据特定的癌症和细胞环境，MUC4的作用似乎很复杂。因此，MUC4在人类肿瘤中的表达和功能尚不清楚。研究表明，miRNA长度约为20nt，在发挥功能前会诱导形成沉默复合物(miRISC)，该复合物通过碱基互补的方式与靶基因mRNA的3'-非翻译区(3'-UTR)结合，导致它们的翻译抑制、去腺苷酸化和衰变，从而调控靶基因的表达[31-32]。本研究通过双荧光素酶报告基因检测并通过人工合成miR-150类似物转染人类宫颈癌细胞，证明miR-150可能通过靶向结合MUC4基因的3'-UTR区域，抑制其基因表达。由于miR-150的靶基因众多，需进一步研究miR-150通过宫颈癌中的MUC4作为肿瘤抑制因子的功能。

综上所述，miR-150具有抗肿瘤特性并抑制宫颈癌细胞的生长与侵袭，增加宫颈癌细胞的自噬。miR-150可直接靶向MUC4，其可能是通过下调MUC4进而调控宫颈癌细胞的生物学行为。本研究可为宫颈癌的诊断和治疗策略提供新的见解。