SIRT1通过调控TET2促进小于胎龄儿下丘脑中星形胶质细胞分化*

山 丹，时青云

(首都医科大学附属北京妇产医院 北京妇幼保健院产科，北京 100026)

小于胎龄儿(small for gestation age,SGA)是指出生体重在相同胎龄儿平均体重的第10个百分位以下，或胎龄满37孕周出生体质量低于2500g的婴儿。流行病学调查数据显示，全球新生儿的SGA发生率为2.3%～10.0%，中国为3.4%～9.0%[1]。胎龄较小不仅增加新生儿的死亡风险，而且胎龄较小的婴儿神经发育迟缓、成年后肥胖的风险也高于正常婴儿。研究报道，SGA下丘脑神经发育调控异常，导致异常的食欲/生理饱足感和细胞信号反应，出现青春期体重快速追赶以及成年后肥胖[2]。此外，SGA在学龄期的认知能力、注意力集中能力、运动协调能力、记忆功能以及反应灵敏度等方面的表现均低于正常胎龄出生的儿童[3-4]。有研究证明，SGA因在宫内处于营养不良环境，发育潜力受限，对下丘脑神经前体细胞(neural precursor cells，NPCs)的增殖分化产生不利影响，具体表现为增殖减少，优先分化为星形胶质细胞[5]。

SIRT1(silent mating type information regulation 1)属于依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的Ⅲ类组蛋白脱乙酰基酶，可通过乙酰化调控多种转录因子，具有一定的神经保护作用[6]。SIRT1作为“细胞能量传感器”参与体内多种生理功能的调节，包括胚胎时期的神经发生[7-8]。大部分SGA的发生是由胎盘功能不全导致，存在缺氧，因此SGA在宫内长期处于氧化应激状态。在SGA下丘脑中，氧化应激可通过调节SIRT1的高表达，促使NPCs向星形胶质细胞分化[9]。DNA甲基化是主要的表观遗传机制之一，能够调节NPCs的细胞命运并控制神经元和神经胶质细胞的顺序生成[10]。DNA甲基化也是星形胶质细胞分化的内在关键决定性因素，经典星形胶质细胞标记物(GFAP)启动子的甲基化与GFAP的活性表达以及星形胶质细胞的生成呈负相关[11-12]。TET甲基胞嘧啶双加氧酶2(TET2)作为DNA去甲基化过程中的关键酶，能够改变DNA甲基化状态，从而触发被动的DNA去甲基化[13]。研究证明，TET2在星形胶质细胞中高度表达，通过对星形胶质谱系基因的去甲基化作用，促使神经前体细胞分化趋势由神经元转换为星形胶质细胞[14]。SIRT1与DNA甲基化密切相关，TET2的活性表达受SIRT1调控[15]。Sun等[16]运用RNA筛选和蛋白质组学分析表明，SIRT1使骨髓增生异常综合征中干细胞的TET2催化域中保守的赖氨酸残基处脱乙酰，增强了TET2的活性。鉴于SIRT1与TET2均对神经前体细胞的分化产生影响，且SIRT1对TET2的活性具有调控作用，因此，推测在SGA下丘脑中，SIRT1可能通过影响TET2的活性来调节星形胶质细胞活化标记物(GFAP)启动子区域的甲基化水平，从而介导SGA下丘脑神经前体细胞向星形胶质细胞的分化,促进星形胶质细胞的生成。本研究通过构建SGA动物模型，采用体外细胞培养的方法，探讨SIRT1和TET2在NPCs向星形胶质细胞分化过程中的调控关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD孕鼠：购自北京维通利华实验动物技术有限公司，本研究已通过伦理审查，得到北京首都医科大学动物研究委员会的批准(伦理编号：AEEI-2019-111)，并按国家批准的实验室动物保护和使用机构指南进行。

1.2 主要试剂和材料 Neurobasal培养基、B27(50x)、肝素荧光素偶联物购自美国Thermo公司，GFAP抗体(GTX34756)和Tuj1抗体(GTX130245)(美国GeneTex公司)，TET2多克隆抗体(BS7804)(美国bioworld公司)，SIRT1抗体(DF6033)和Nestin抗体(DF7754)(Affinity公司)，SIRT1抑制剂(sirtinol)(ab141263)购自英国Abcam公司，SIRT1激活剂白藜芦醇(ST1623)(上海碧云天生物技术有限公司)，大鼠表皮生长因子(美国Peprotech公司)，逆转录试剂盒和RT-PCR荧光定量试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)，甲基化特异性PCR试剂盒和DNA重亚硫酸盐转化试剂盒购自天根公司，辣酸根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(bs-0295G-HRP)(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 构建SGA大鼠模型 将12只无特定病原体级(specific pathogen free,SPF)的SD(Sprague-Dawley)孕鼠随机分为SGA组和对照组,各6只，体质量约200～300g，日龄90～120d,在室温(18～25℃)、相对湿度为60%～70%的无菌屏障系统内饲养。对照组给予繁殖饲料喂养，妊娠期间不限制饲料和饮水；SGA组给予8%低蛋白饲料喂养，自孕10天起，给予50%限制饮食(依据对照组前一天的正常平均饮食量)。

1.3.2 分离培养神经前体细胞 分别在SGA组和对照组每只孕鼠生产的幼崽中随机取4只子代鼠(均为雄性)，腹腔注射10%水合氯醛,按0.5mL/100g剂量处死，无菌条件下分离各组子代鼠脑组织，将大脑转移至DMEM/F12培养基中，分离下丘脑。将分离好的下丘脑组织剪碎，用0.1%胰蛋白酶-EDTA在37℃的CO2培养箱中分解5min，用10%FBS溶液清洗，使胰蛋白酶失活，将分解后的细胞过滤,1000r/min离心5min，弃上清,置完全培养基(CM，5×104/mL，由Neurobasal培养基、1% 抗体、2% B27、20ng/mL FGF2、20ng/mL EGF、1μg/mL肝素和2.5μg/mL的L-谷氨酰胺配制而成)中，在CO2培养箱中培养8～9天，每三天更换一次培养基，收集P0代神经球，相同过程再培养8～9天后，收集P1代细胞。各组P1代细胞解离后重悬于分化培养基(DM，不加FGF2、EGF、肝素)，随机分为3组:第一组加入SIRT1抑制剂(sirtinol);第二组加入SIRT1激活剂(白藜芦醇);第三组为空白对照组，培养8～9天后收集细胞进行检测。

1.3.3 QT-PCR检测SGA大鼠下丘脑神经前体细胞中SIRT1、TET2、GFAP的mRNA表达 采用Trizol法提取样本总RNA，根据逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行逆转录聚合酶链反应扩增。引物序列：SIRT1上游为5'-TGAGAGAAGTCAGCATCGCATTG-3'，下游为5'-ATGGAGGCTCACAGTGATAGG-3'；TET2上游为5'-GGAGGAGAAGAGTCAGGAGGTTAGTG-3'，下游为5'-CCGAAGTTGTGCTGTCATCTGTATCA-3'；GFAP上游为5'-TGAGGAAGATCCATGAGGAGGAAGTT-3'，下游为5'-AGTTGGCGGCGATAGTCATTAGC-3'；GAPDH上游为5'-GGCAAGTTCAACGGCACAG-3'，下游为5'-CGCCAGTAGACTCCACGACA-3'。反应条件：95℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法进行定量分析，计算SIRT1、TET2、GFAP的相对表达量。

1.3.4 Western blot法检测SIRT1、TET2、GFAP蛋白表达 收集各组细胞，提取细胞总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度，按10μL/孔的上样量进行SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭，一抗4℃过夜孵育，TBST充分洗涤，加相应HRP标记二抗，室温孵育1h，加化学发光剂，用全自动化学发光图像分析系统进行曝光，以GAPDH为内参，用Image J软件分析灰度值。

1.3.5 免疫荧光测定下丘脑神经前体细胞中Tuj1/GFAP比例 将下丘脑组织用石蜡包埋，切片，用二甲基苯脱蜡两次，每次10min，通过梯度渗透洗脱酒精；组织切片置于3%过氧化氢溶液中浸泡15min，PBS洗涤，柠檬酸钠溶液进行抗原回收;用PBS溶液洗涤3次，每次5min，山羊血清室温封闭2h，弃血清，按1∶200比例加一抗GFAP，按1∶500比例加一抗Tuj1，4℃湿盒过夜，PBS洗涤，羊抗兔抗体(1∶200)室温下避光孵育2h，PBS洗涤，加DAPI染料(1∶50稀释)染色10min，PBS洗涤，抗荧光猝灭封片剂封片，荧光显微镜下观察，使用Image J软件分析光密度值。

1.3.6 下丘脑神经前体细胞中GFAP启动子区域的甲基化测定 用动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取DNA，将获取的DNA置于-20℃保存备用。采用核酸定量仪检测DNA含量和纯度。用甲基化特异性PCR试剂盒对DNA样本进行重亚硫酸盐转化，PCR反应条件：95℃ 5min，1个循环；94℃ 20s,60℃ 30s，72℃ 20s，35个循环后72℃ 5min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。GFAP启动子甲基化上游引物：5'-ATATAGTGAATTTTAGGGGATACGA-3',下游引物：5'-CTCTACTCCATACCAAAAACACGAT-3'；未甲基化上游引物：5'-ATATAGTGAATTTTAGGGGATATGA-3'，下游引物：5'-CTCTACTCCATACCAAAAACACAAT-3'。MSP结果判读：完全甲基化：甲基化特异引物扩增出目的条带，而非甲基化特异引物没有扩增出目的条带；部分甲基化：甲基化特异引物和非甲基化特异引物均扩增出目的条带；非甲基化：非甲基化特异引物扩增出目的条带，而甲基化特异引物没有扩增出目的条带。本研究将完全甲基化与部分甲基化均按甲基化统计。

2 结 果

2.1 出生体重的比较 所有后代鼠的体重均为自然分娩后第一天立即测量所得。SGA组的所有后代鼠(不区分性别)体重均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，表明建模成功，见表1。

表1 SGA组和对照组不同孕周后代鼠体重对比

2.2 小于胎龄子代鼠下丘脑NPCs分化改变及SIRT1、TET2、GFAP的表达变化

2.2.1 SGA大鼠下丘脑中NPCs分化为星形胶质细胞的比例增加 GFAP为星形胶质细胞的活化标记物，Tuj1为神经元活化标记物。免疫荧光结果显示，SGA组子鼠下丘脑组织中GFAP表达增加，Tuj1表达减少，神经元与星形胶质细胞的比例(Tuj1/GFAP)与对照组相比显著降低，差异有统计学意义(P<0.001)。两组子鼠下丘脑荧光染色见图1，Tuj1/GFAP荧光光密度值比值对比见图2。

图1 对照组和SGA组子鼠下丘脑GFAP、Tuj1免疫荧光染色(100×)红色荧光为GFAP表达，绿色荧光为Tuj1表达，蓝色荧光为DAPI核染

2.2.2 SGA子鼠下丘脑中SIRT1、TET2、GFAP蛋白和mRNA表达增加 Western blot结果表明，与对照组相比，SGA组子鼠下丘脑组织中SIRT1(P<0.01)、TET2(P<0.05)、GFAP(P<0.05)蛋白表达均显著增加，见图3。RT-PCR定量分析结果显示,与对照组相比，SGA组子鼠下丘脑组织中SIRT1(P<0.01)、TET2(P<0.01)、GFAP(P<0.05)mRNA表达增多，见图4。

2.2.3 SGA组子鼠下丘脑GFAP启动子区域甲基化水平降低 SGA组子鼠GFAP启动子区域甲基化水平降低，非甲基化水平增高。电泳条带灰度值分析结果见图5A。甲基化/非甲基化灰度值比值分析见图5B，结果表明，SGA组子鼠GFAP启动子区域甲基化/非甲基化水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 对照组和SGA组子鼠下丘脑Tuj1/GFAP双重免疫荧光染色平均荧光光密度比值分析

图3 对照组及SGA组子鼠下丘脑SIRT1(A)、TET2(B)、GFAP(C)蛋白表达

图4 对照组及SGA组子鼠下丘脑SIRT1(A)、TET2(B)、GFAP(C)mRNA的表达

2.3 SIRT1介导的TET2活性变化促进星形胶质细胞分化

2.3.1 SIRT1调控下丘脑神经细胞中的TET2表达进而调节GFAP表达水平 神经前体细胞体外分化培养，收集细胞，Western blot法分析SIRT1、TET2、GFAP蛋白表达。SGA组子鼠的SIRT1表达高于对照组(P<0.01)(图6A、B)，分别在SGA组和对照组培养基中加SIRT1抑制剂sirtinol(50μmol/L)，培养8天后，收集细胞。相对于未添加抑制剂或激活剂组，SIRT1表达受明显抑制(P<0.05)；同样，加SIRT1激活剂白藜芦醇(50μmol/L)培养8天后，SIRT1表达增加(P<0.05)。表明加入的相关酶试剂对SIRT1的抑制及激活有效。相比于对照组，SGA组子鼠的TET2、GFAP蛋白表达增加(图6C、D)，差异具有统计学意义(P<0.05)。在加sirtinol培养后，对照组和SGA组的TET2、GFAP表达均减少，低于各自未做处理的空白组，差异有统计学意义；在加白藜芦醇培养后，对照组和SGA组的TET2、GFAP表达均增加，高于各自未作处理的空白组，差异均有统计学意义(图6C、D)。RT-PCR法分析对照组、SGA组SIRT1、TET2、GFAP在不同处理条件下的mRNA表达，结果同Western blot(图7)。

图5 对照组及SGA组子鼠下丘脑GFAP启动子区域甲基化水平分析

图6 对照组及SGA组子鼠下丘脑SIRT1、TET2、GFAP蛋白的表达

2.3.2 SIRT1介导的TET2活性改变、调节GFAP启动子区域的甲基化水平 MSP法测定体外培养神经细胞中GFAP启动子区域的甲基化水平，见图8。与对照组相比，SGA组子鼠的GFAP启动子区域甲基化水平降低，非甲基化水平升高，加sirtinol干预后，SGA组和对照组的甲基化水平均升高，非甲基化水平均降低。用白藜芦醇干预后，SGA组和对照组的甲基化水平均降低，非甲基化水平均增加。电泳条带灰度值分析结果显示，SGA组的甲基化水平低于对照组，加sirtinol的SGA组和对照组甲基化水平相对于各自的空白处理组均有所升高，差异有统计学意义(P<0.01),加白藜芦醇处理后SGA组和对照组甲基化水平均降低，低于各自的空白处理组，差异有统计学意义。

图7 control组及SGA组子鼠下丘脑SIRT1(A)、TET2(B)、GFAP(C)mRNA的表达

图8 control组及SGA组子鼠GFAP启动子区域甲基化水平分析

3 讨 论

SGA一直以来都受到广泛关注。SGA不仅会导致围产期的死亡率和患病率增加，还会引起儿童生长时期甚至成年后发育和代谢异常。目前国内外建立SGA动物模型主要有外科手术法、被动吸烟法、母体营养不良法、饥饿(限制饮食)法[17],其中限制饮食法的应用较为广泛且成熟。本研究运用限制饮食法，具体采用8%低蛋白饮食喂养、孕10天起50%限制饮食进行建模，以SGA组子鼠出生体重低于对照组出生体重2个标准差为建模成功标准，结果显示对照组后代鼠体重明显大于SGA组后代鼠，SGA模型建立成功。SGA由于神经发育迟缓，在婴儿期、学龄期的认知能力和学习能力低下，青春期出现体重追赶性增长以及成年后肥胖的风险增加[18]。在哺乳动物大脑中，NPCs分化为神经元和胶质细胞对维持大脑功能、保证其正常发育具有重要意义，NPCs是一种终生具有自我更新能力的细胞，诱导后可分化为特定类型的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞[19]。在大脑皮层的正常发育过程中，NPCs首先分化为神经元，随后逐渐分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞[20]。研究发现，SGA下丘脑NPCs增殖分化受损，提前且倾向于分化为星形胶质细胞，导致下丘脑中调控食欲的神经元发育异常[21]。本实验研究中，利用双重免疫荧光染色对星形胶质细胞的活化标记物(GFAP)以及神经元的标记物(Tuj1)在新生大鼠下丘脑中的表达进行了分析，结果表明SGA新生大鼠下丘脑中的GFAP表达高于正常组，而Tuj1表达降低，提示SGA子鼠下丘脑NPCs存在分化异常，分化为星形胶质细胞的比例增多。

近年来，国内外越来越多的研究表明，异常的DNA甲基化会影响胎儿的宫内发育，与小于胎龄儿的发生有关[22-24]。DNA甲基化在神经发生的过程中起多种作用，NPCs早期分化为神经元时，神经胶质谱系基因被DNA甲基化作用所抑制[25]，因此，DNA甲基化的异常变化能影响NPCs的分化命运，对神经元及星形胶质细胞的存活至关重要。目前普遍认为，DNA甲基化水平与基因表达成反比，高甲基化水平会抑制基因的表达[26]。GFAP启动子区域的甲基化水平是胚胎神经发生过程中星形胶质细胞分化的关键决定因素，GFAP的活性表达以及星形胶质细胞的生成与GFAP启动子区域的甲基化水平呈负相关[11-12]。我们利用甲基化特异性PCR(MSP)方法测定SGA和正常新生大鼠下丘脑组织中GFAP启动子区域的的甲基化水平。结果显示SGA子鼠的GFAP甲基化水平明显低于正常对照组，与GFAP的蛋白及mRNA表达增加这一结果相符，证明了SGA下丘脑中GFAP的活性增加可能与其启动子区甲基化水平降低相关。DNA去甲基化依赖于去甲基化酶，TET2(ten-eleven translocation)蛋白是一种α-酮戊二酸和Fe2+依赖的双加氧酶，是DNA去甲基化过程中的一种重要的酶，将5-甲基胞嘧啶(5mc)氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)，而5hmc的沉积触发被动的DNA去甲基化[27]。He等[14]发现，TET2的过表达促进NPCs向星形胶质细胞分化，使用shRNA敲低TET2的表达后，明显降低了NPCs向星形胶质细胞分化的比例，这一结果也说明了TET2是星形胶质细胞谱系分化的关键调节剂。本研究结果显示，SGA大鼠下丘脑组织中TET2、GFAP表达均高于对照组，且GFAP的DNA甲基化水平降低，提示在SGA子鼠的下丘脑中，GFAP启动子区域甲基化水平的降低可能是被TET2活性的变化所调控。

TET2的活性受乙酰化作用的调节[28]。SIRT1属于依赖NAD+的Ⅲ类组蛋白脱乙酰酶，与组蛋白乙酰基酶共同维持细胞核的乙酰化平衡。最近一项关于骨髓增生异常综合征中造血干细胞的研究表明，SIRT1与TET2催化域中的保守赖氨酸残基融合，从而增强了TET2的活性，抑制造血干细胞的异常增殖[29]。Simeoni等[30]研究发现，SIRT1对TET2催化域内的K1472、K1473和K1478等保守赖氨酸残基位点进行脱乙酰化可增强TET2与DNA的相互作用，提高TET2的催化活性。此外，SIRT1参与体内许多生理功能的调节，在胚胎发育时期，SIRT1在脑部高度表达，影响神经元和脑发育[31]。Desai等[9]对SGA动物模型进行体外神经球培养实验，研究表明，SGA新生儿和成年后代的下丘脑中NPCs增殖减少，神经元标记物Tuj1降低，SIRT1表达增加。沉默SIRT1后，NPCs增殖恢复正常水平，Tuj1表达增加。证明了SGA下丘脑中SIRT1高表达诱导了NPCs的过早分化，减少其增殖，使NPCs向星形胶质细胞分化增加，分化为神经元的数目变少。

为进一步验证SGA下丘脑中SIRT1与TET2之间是否存在调控关系以及对NPCs向星形胶质细胞分化的影响，本实验通过体外神经细胞培养的方式，通过在培养基中加入SIRT1抑制剂(sirtinol)或SIRT1激活剂(白藜芦醇)对SIRT1的活性进行干预处理，各组SIRT1表达均被有效干预。与不做处理的空白组相比，加入sirtinol组的TET2及GFAP活性降低，加入白藜芦醇组的TET2、GFAP活性增加。表明在SGA下丘脑NPCs分化时，SIRT1的高表达增加了TET2的活性，使GFAP表达增加，星形胶质细胞分化增加。为明确这一调控过程是否是通过影响GFAP启动子区域甲基化水平而实现，采用MSP方法测定不同干预条件下各组的GFAP启动子区域甲基化水平，结果表明，加入sirtinol的SGA组GFAP启动子区域甲基化水平增加，非甲基化水平降低，加入白藜芦醇后，SGA组GFAP启动子区域的甲基化水平降低，非甲基化水平增加。提示SGA下丘脑中SIRT1可能通过介导TET2的活性改变，调节GFAP启动子区域的甲基化水平，从而影响星形胶质细胞的分化。

综上所述，在SGA下丘脑中，SIRT1的高表达可能增强了TET2的活性，继而改变TET2的功能，使GFAP启动子区域的DNA去甲基化水平增加，从而增加GFAP表达，促进星形胶质细胞的分化。