抑郁模型小鼠海马中胆汁酸受体变化的研究

吴 静，李学义，陈京红，王泽剑

1.上海交通大学药学院，上海 200240；2.上海交通大学医学院附属精神卫生中心，上海 200030

重度抑郁症（major depressive disorder，MDD）是神经精神疾病中最重要的疾病之一，也是一种基因与环境交互影响的异质性重大精神疾病，以显著而持久的心境低落与兴趣减少为主要临床特征。目前现有临床药物对约30%MDD 患者的临床疗效欠佳。因此，抑郁症仍需寻找新的治疗靶点［1］。

女性MDD 发生率约为男性的2 倍，其高发年龄段分别为青春期、孕产期和绝经期；这3 个阶段均与女性体内雌激素水平急剧改变有关。现代医学认为：雌激素受体属于核受体之一，高水平雌二醇可以干扰肝脏胆汁酸受体后信号造成肝内胆汁淤积［2］。清代叶天士在《临证指南医案》中指出：“女子以肝为先天。”《中医基础理论》中藏象学说指出：肝“主疏泄，其性升发，喜条达恶抑郁，以舒畅全身气机，调节情志”。由此可见，女性更容易受情绪影响出现“郁证”。传统中医认为：抑郁症属于“郁证”的范畴，其发生与肝郁气滞或肝郁脾虚有关。因此，中医常采用疏肝、利胆、健脾的方法如解郁丸、逍遥丸等治疗［3-4］，临床起效快，并有确切疗效。胆汁酸在肠道主要通过其受体发挥抗炎、抑菌作用。牛磺熊去氧胆酸可减轻脂多糖诱发的小鼠抑郁样行为及神经炎［5］；它可能是通过小胶质细胞膜上G 蛋白偶联胆汁酸受体1（G protein-coupled bile acid receptor 1，GPBAR1，又称为TGR5）发挥抗炎作用［6］。这些结果提示脑内同样存在胆汁酸受体，但其功能尚不完全清楚。

下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴是哺乳动物的一个生物稳态调节系统，在各种生理、病理性应激反应中发挥长期调节作用。HPA 轴功能障碍在抑郁症和慢性疲劳综合征等神经内分泌疾病中得到了广泛的研究。有研究［7-8］表明，HPA轴功能异常在女性MDD 形成中作用更为显著。C57BL/6 小鼠压力应激诱导下产生的应激行为可以被糖皮质激素的拮抗剂所逆转［9］。海马是MDD 研究中常见的脑区之一。MDD 患者尸检［10］发现：海马CA1区体积减小，伴星形胶质细胞大量丢失和萎缩。本实验采用在体动物实验和离体细胞学研究相结合的方法，初步探索抑郁症患者脑内海马区胆汁酸受体变化及相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及细胞 SPF 级C57BL/6 健康雌性小鼠，4 周龄，体质量15～17 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物生产许可证号为SCXK （沪）2017-0005。小鼠饲养于上海交通大学动物实验中心，环境温度（22±3）℃、湿度40%～70%、12 h 明暗交替；实验动物使用许可证号为SYXK（沪）2018-0028。实验动物操作经上海交通大学动物伦理委员会批准，伦理批号为20181112。

大鼠胶质瘤细胞（C6）购于中国科学院上海细胞库，细胞使用含有10%胎牛血清的F-12 培养基，于5%CO2、37 ℃培养箱中培养。

1.1.2 实验试剂 TGR5 一抗购于英国Abcam 公司，甘油醛-3- 磷酸脱氢酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗体购于美国Bioworld公司，β-肌动蛋白（β-actin） 抗体、法尼脂X 受体（farnesoid X receptor，FXR）一抗和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）一抗购于美国Proteintech公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔和山羊抗鼠抗体购于美国Jackson ImmunoResearch公司，地塞米松（dexamethasone，DEX）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，小鼠成纤维细胞生长因子15（fibroblast growth factor 15，FGF15） ELISA 试剂盒、小鼠胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK） ELISA 试剂盒、大鼠BDNF ELISA 试剂盒和大鼠胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）ELISA 试剂盒购于上海榕珉生物（XLPCC）公司，RIPA 蛋白裂解液、BCA 检测试剂盒、活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 将30 只小鼠适应性饲养1 周后，按照随机分配方法分为3组，对照（control，CON）组、慢性不可知性应激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）组和DEX 组，每组10 只。DEX 组按每次2.0 mg/kg 的剂量给予DEX 灌胃，每日2 次（上午8 点和下午5 点）；CON 组和CUMS 组同样每日灌胃2 次，给予等体积的溶剂（羧甲基纤维素钠，CMC-Na）。造模时间5 周，每周固定时间称取小鼠体质量。

1.2.2 CUMS 模型的建立 CUMS 组在每日灌胃处理之后给予不同刺激造模，持续5 周。刺激方法为昼夜颠倒、冰水游泳5 min、倾斜鼠笼45°、潮湿垫料、电击鼠尾、束缚3 h、禁水禁食、噪声刺激3 h。刺激方式每日随机产生，同一种刺激方式不能连续出现。除部分CUMS 刺激周期内，小鼠其他时段均正常提供饮食。

1.2.3 行为学研究

（1） 强迫游泳实验（forced swimming test，FST） 将小鼠单独放置在直径14 cm、水深20 cm 的烧杯内，水温22 ℃。游泳时长6 min，记录小鼠后4 min内静止不动的时间。每只小鼠结束实验后，及时换水，避免对后面实验小鼠产生影响。

（2） 悬尾实验（tail suspension test，TST） 安静环境下，将实验小鼠尾部末端1/3处固定在实验装置上，倒置小鼠。实验记录6 min，记录小鼠后4 min内静止不动的时间。

（3） 糖水偏好实验（sucrose preference test，SPT）小鼠首先进行糖水适应性实验，待适应性实验结束后小鼠正式进行SPT。禁水禁食24 h，24 h 后进行实验，每只鼠笼放入2瓶100 mL的水，一瓶为1%蔗糖溶液，一瓶为纯净水。12 h 后调换2 瓶水的位置，24 h 后结束实验，记录糖水和纯水消耗量。计算糖水消耗百分比=糖水消耗量/（糖水消耗量+纯净水消耗量）×100%。

1.2.4 ELISA 检测血清中FGF15 和CCK 含量 小鼠完成行为学实验之后进行眼球取血，血液于4 ℃静置2 h，5 300×g离心15 min，收集上清液，-80 ℃保存备用。使用小鼠FGF15 和CCK ELISA 试剂盒，按说明书进行检测，于波长450 nm 处测定吸光度（D），绘制标准曲线，根据标准曲线获得样品浓度。

1.2.5 小鼠脏器质量及组织分离 实验结束后，称取小鼠体质量，颈椎脱臼处死，分别取出脑、心脏、肝脏、脾、肺、肾脏、胸腺及胆囊，用吸水纸吸干不同脏器表面血迹及体液，置于电子天平上（精度为0.000 1 g），称取各脏器质量，比较各组脏器系数差异，脏器系数=脏器质量/小鼠体质量。脑组织称重结束后，在冰上迅速分离两侧海马组织，并立即置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.2.6 Western blotting 检测小鼠海马组织及C6 细胞中相关蛋白水平变化 从-80 ℃冰箱取出海马组织，加入RIPA 蛋白裂解液，使用匀浆机在冰上裂解30 min，于4 ℃，12 000×g离心10 min 取上清液。C6 细胞使用25、50、100、200 和400 μmol/L DEX 处理3 d 后，去除培养基，使用RIPA 蛋白裂解液裂解后，于4 ℃，12 000×g离心10 min 取上清液。利用BCA 试剂盒测定蛋白浓度，根据不同蛋白的相对分子质量选择合适浓度的聚丙烯酰胺凝胶。随后进行蛋白变性、上样、电泳、转膜和封闭，一抗4 ℃孵育过夜，次日洗膜，加入二抗孵育，最后用ECL发光液曝光、显影，以GAPDH或β-actin作为内参，以目的蛋白和内参的灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.2.7 ELISA 检测C6 细胞培养基中GDNF 和BDNF 含量 C6 细胞使用不同剂量DEX 处理3 d 后，收集细胞培养基，使用大鼠BDNF 和GDNF ELISA 试剂盒检测细胞培养基中BDNF和GDNF的含量。

1.2.8 细胞内ROS 含量检测 C6 细胞使用DEX 200 μmol/L 进行处理，处理3 d 后，去除细胞培养基，使用胰酶消化，收集细胞；每管加入100 μL浓度为10 mol/L的DCFH-DA 荧光探针，37 ℃细胞培养箱孵育20 min，孵育结束后，使用无血清培养基洗涤3次，去除多余的荧光探针；随后每管加入200 μL 无血清培养基，使用荧光检测仪检测荧光强度，激发波长488 nm，发射波长525 nm；同时使用细胞计数仪对细胞进行计数，以荧光强度/细胞数代表细胞内ROS含量。

1.2.9 N-乙酰-L-半胱氨酸处理C6 细胞 C6 细胞先加入5 mmol/L N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）处理2 h，然后加入200 μmol/L DEX 孵育3 d，提取细胞内蛋白，使用Western blotting 检测细胞内蛋白水平变化。

1.3 统计学分析

采用软件GraphPad Prism7.0 和SPSS 22.0 对数据进行统计学处理。定量资料用±s表示，满足正态分布的数据采用t检验或单因素方差分析检验或双因素方差分析检验，进一步组间两两比较使用Student-Newman-Keuls 检验；非正态分布数据采用非参数检验（Kruskal-Wallis 秩和检验）进行事后分析。

2 结果

2.1 小鼠体质量

建模完成后发现各组小鼠体质量差异有统计学意义（P<0.05）（图1）：与CON 组比较，CUMS 组的体质量显著下降（P<0.05），DEX 组小鼠的体质量与CON 组相比显著上升（P<0.05）。

图1 小鼠建模过程中体质量动态变化趋势Fig 1 Dynamic change trend of body mass in mice during modeling

2.2 行为学指标

2.2.1 FST 建模后各组小鼠不动时间差异具有统计学意义（P<0.05）（图2A）：与CON 组相比，CUMS 组和DEX组不动时间均显著延长。

2.2.2 TST 建模后各组小鼠不动时间差异具有统计学意义（P<0.05）（图2B）：与CON 组相比，CUMS 组和DEX组不动时间均显著延长。

2.2.3 SPT 建模后各组小鼠糖水消耗百分比差异具有统计学意义（P<0.05）（图2C）：与CON 相比，CUMS 组和DEX组糖水消耗百分比均降低。

图2 小鼠建模完成后行为学指标变化Fig 2 Behavioral changes after mice modeling

2.3 小鼠脏器系数比较

对各脏器系数进行组间比较发现，各组小鼠胆囊系数差异具有统计学意义（P<0.05）：与CON 组相比，CUMS组和DEX组胆囊系数均显著上升（图3A）。

2.4 外周血中FGF15和CCK的含量

ELISA 结果显示，FGF15 在DEX 组和CUMS 组中呈相反趋势，CUMS组较CON组显著下降（P<0.05），DEX组则显著上升（P<0.05）；CCK 含量在CUMS组中显著上升（P<0.01），DEX 组与CON 组相比差异无统计学意义（P>0.05）（图3B、C）。

图3 各组小鼠胆囊系数及血清中FGF15和CCK的含量Fig 3 Gallbladder organ coefficient and serum levels of FGF-15 and CCK in each group

2.5 海马中BDNF、TGR5、FXR蛋白的表达水平

各组小鼠海马组织中BDNF 蛋白表达水平差异不具有统计学意义，FXR和TGR5蛋白表达水平差异具有统计学意义（均P<0.05）。与CON 组相比，CUMS 组和DEX组FXR蛋白表达水平显著上升，TGR5蛋白表达水平显著下降（均P<0.05）（图4）。

图4 小鼠建模后海马内相关蛋白水平的变化Fig4 Changes in related protein levels in mouse hippocampus after modeling

2.6 C6细胞中FXR、TGR5蛋白的表达水平

为研究HPA 轴功能异常对星形胶质细胞功能影响，我们采用胶质细胞系C6细胞建立体外模型。C6细胞使用25、50、100、200 和400 μmol/L DEX 孵育3 d 后，200 μmol/L 和400 μmol/L DEX 组与对照组相比，FXR 蛋白表达水平显著升高（均P<0.05），TGR5 蛋白表达水平显著下降（均P<0.05，图5）。

图5 C6细胞使用DEX处理后相关蛋白水平的变化Fig 5 Changes in related protein levels in C6 cells treated with DEX

2.7 C6细胞分泌神经营养因子的水平

C6细胞使用25、50、100、200和400 μmol/L的DEX孵育3 d 后，400 μmol/L 组与对照组相比，BDNF 含量在培养基中显著下降（P<0.05，图6A），50、100、200 和400 μmol/L 组与对照组相比GDNF 含量显著下降（均P<0.05，图6B）。鉴于该结果，后续研究采用200 μmol/L DEX作为体外模型的造模剂量。

图6 C6细胞使用DEX处理后培养基中神经营养因子的含量变化Fig 6 Changes of BDNF and GDNF concentrations in the cell culture medium in C6 cells treated with DEX

2.8 C6细胞内的ROS水平

C6细胞在使用200 μmol/L的DEX孵育3 d后，与对照组相比，荧光强度显著增强，ROS水平显著升高；经量化检测，200 μmol/L DEX组的荧光强度约是对照组的4倍，差异具有统计学意义（P<0.05）。由此可见，C6 细胞经200 μmol/L DEX孵育后，ROS水平显著升高（图7）。

图7 C6细胞加入DEX孵育3 d后细胞内ROS水平的变化Fig7 Change of ROS level in the C6 cells treated with DEX for 3 d

2.9 NAC对DEX造成C6细胞FXR和TGR5改变的影响

在200 μmol/L DEX 处理前，加入5 mmol/L NAC 预处理2 h，Western blotting 检测细胞内FXR 和TGR5 表达水平。由图8 可以看出，DEX+NAC 组C6 细胞内FXR 含量较DEX 组显著降低（P<0.05）；TGR5 含量略上升（P>0.05），但差异无统计学意义。

图8 NAC预处理2 h对DEX处理3 d的C6细胞内FEX和TGR5表达变化的影响Fig 8 Effect of NAC pretreatment for 2 h on the expression of FEX and TGR5 in the C6 cells treated with DEX for 3 d

3 讨论

目前MDD 动物造模方法有皮质类固醇喂养、CUMS以及获得性无助等。由于青春期是女性MDD 的高发年龄段［11］，因此本研究采用4周龄雌性小鼠用于本次试验。

CUMS 模型是目前经典动物抑郁模型，具有与MDD相似的一系列神经生物学效应，包括HPA 轴异常、海马神经再生障碍、神经递质水平改变等［12-13］；但由于各实验室CUMS 应激顺序和方式不同，其糖水偏好实验往往重复性较差［14］。另外，高水平皮质类固醇激素长期暴露可模拟慢性应激［15］，其HPA 轴的功能障碍与MDD 患者相似，伴随快感消失；且由于类固醇激素可以精确定量，其在快感缺失的糖水偏好实验中重复性较好。本研究利用2种雌性抑郁动物模型，探索抑郁行为与外周胆汁酸受体后信号和中枢胆汁酸相关受体变化的关系。

与CON 组相比，2 种雌性动物模型均显示出了明显的快感消失、悬尾及游泳不动时间延长，提示2种抑郁动物模型成功。动物解剖过程中发现抑郁模型动物胆囊体积增大，与CON 组相比胆囊系数差异有统计学意义。为此，我们检测了外周血清中FGF15 和CCK。胆汁酸激活小肠上皮细胞内FXR 后，可产生FGF15，负反馈性抑制肝脏胆酸从头合成途径。

肝脏细胞内FXR 激活后可促进肝脏胆酸排泄，抑制胆酸肠肝循环。以往文献显示：DEX 低剂量可促进胆汁酸转运和排出，高剂量可通过非FXR 依赖方式抑制胆汁酸合成及转运调控作用［16-17］，因此DEX 可用于治疗胆汁淤积性肝炎。与CON 组相比，DEX 组血清FGF15 含量显著增加，伴随有CCK 下降趋势，提示DEX 促进胆汁酸转运入盲肠，刺激肠道FXR/FGF15 通路，抑制肝脏胆汁酸从头合成途径；由于CCK 水平的降低，胆囊收缩能力下降，可能与本研究中胆囊系数增加有关。与CON 组相比，CUMS 组血清FGF15 含量显著减少（提示肝脏分泌进入肠道的胆汁酸含量减少），CUMS 组CCK 显著增加；虽然CCK 可收缩胆囊，但高水平的CCK 也可抑制胃肠道蠕动，造成动物食量下降，体质量减轻，其结果符合中医“肝失疏泄，横逆犯胃，胃失和降”的描述。因此，2组不同抑郁模型可能与外周原发性和继发性的胆汁酸代谢异常有关，但外周胆汁酸代谢异常如何引起中枢神经系统改变还需进一步研究。

与CON 组相比，雌性抑郁小鼠海马区TGR5 蛋白显著减少，伴随FXR显著增加。TGR5是胆汁酸的细胞膜受体，胆汁酸激动外周TGR5/胰高血糖素样肽-1（glucagonlike peptide 1，GLP-1）途径，在调节糖脂代谢、胆汁代谢以及抑制核转录因子κb（nuclear factor-κb，NF-κb）激活中发挥重要作用［18］；TGR5 在脑卒中动物模型中显示出神经保护作用［6］，而在肝性脑病动物模型的神经胶质细胞中的表达量显著减少［19］，为此我们认为抑郁动物模型海马区TGR5 表达减少可能增强了MDD 模型中海马对慢性应激造成损伤的敏感性。脑内通过慢病毒高表达FXR 蛋白可诱导大鼠产生显著抑郁行为伴随脑内BDNF蛋白量降低［20］，而敲除脑内FXR可阻断CUMS 对大鼠行为学和BDNF的影响；我们首次在2种不同抑郁动物模型中显示脑内海马区胆汁酸膜受体减少，伴随胆汁酸核受体增加。此外，我们发现雌性啮齿类动物造模后脑内海马区BDNF 表达水平未出现明显降低，该结果与以往报道［21］相似，CUMS 造成的海马区BDNF 表达水平降低更容易出现在雄性啮齿类动物中，可能与雌性动物青春期高雌激素水平造成的脑保护作用有关。

我们使用DEX 处理C6 细胞研究HPA 轴功能紊乱对脑内星形胶质细胞的影响。实验发现200 μmol/L 和400 μmol/L DEX 可增加FXR、减少TGR5 的蛋白水平。以往文献显示：FXR 高表达可加重淀粉样蛋白触发的神经细胞凋亡，敲减FXR可以翻转淀粉样蛋白触发的神经细胞凋亡［22］。本研究证实高剂量DEX 可同时造成星型胶质细胞内TGR5 蛋白水平的降低和FXR 蛋白水平的增高，伴随细胞内ROS 水平激增，以及BDNF 和GDNF 显著下降，使用抗氧化剂NAC 可显著逆转FXR 蛋白水平，提示DEX 造成的氧化应激在星型胶质细胞胆汁酸受体异常改变中发挥重要作用。我们推测DEX 造成氧化应激水平升高与胆汁酸受体表达异常有关。

综上，本研究发现DEX和CUMS小鼠抑郁模型中小鼠海马区胆汁酸受体表达改变，该效应可能与HPA轴功能异常造成的星形胶质细胞内高氧化状态有关，NAC可部分逆转DEX造成的星形胶质细胞模型的胆汁酸受体异常。氧化应激造成星形胶质细胞胆汁酸受体改变的具体机制及抗氧化剂是否能够改善小鼠抑郁行为仍有待进一步探索。