桃儿七种子低温层积过程中胚形态及生理生化物质变化

久西加，杜 弢,2*，陈红刚,2，李 飞，徐宠然

(1 甘肃中医药大学和政药用植物园，甘肃和政 731200；2 西北中藏药协同创新中心，兰州 730000)

桃儿七[Sinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying]为小檗科(Berberidaceae)桃儿七属(SinopodophyllumYing)多年生草本植物，其果实及根茎均能入药，具有调经活血的作用[1]。药理学研究表明桃儿七中含有的鬼臼毒素及其衍生物具有明显的抗肿瘤活性，且鬼臼毒素衍生物依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)已在临床上被广泛应用[2-3]。但是由于桃儿七种子所具有的休眠特性及市场需求的进一步增加导致其野生资源匮乏，目前已被列为国家二级保护植物[4-5]。

层积过程中种胚形态的建成和生理生化的变化是种子休眠解除的重要原因。低温层积促进种胚发育从而解除种子休眠，这在银杏[6]、山茱萸[7]等植物上已有印证，王蕾等[8]研究发现大花贝母经层积后其种胚也从点状胚逐步发育至线型胚，从而完成休眠的解除。而层积过程中种子内营养物质及酶活性的变化又在另一层面上影响着种子的休眠状态，如榧树种子中淀粉、粗脂肪含量随休眠解除而下降[9]，滇重楼种子在休眠解除过程中其淀粉、可溶性蛋白含量也呈下降趋势[10]。其次，呼吸途径的转变也是种子休眠解除的关键[11-12],PK、SDH、G-6-PDH作为EMP途径、TCA途径、PPP途径的关键限速酶，一定程度上反映着相应呼吸途径的活化水平[13]，如西洋参种胚后熟过程中,其G-6-PDH酶活性逐渐升高,PPP途径的活化导致休眠的解除[14]。另外，内源激素可对植物内部的多个生理生化过程产生影响[15]，ABA促进种子贮藏蛋白和脂肪的合成,促进种子脱水耐性和种子休眠的获得,抑制种胚萌发;GA促进α-淀粉酶、核酸酶、蛋白水解酶、ATP酶等的表达,解除种子休眠,促进萌发[16-17]；而IAA可能通过间接调控GA和ABA生物合成与信号转导途径从而对种子的休眠与萌发产生作用[18-19]。

桃儿七种子所具有的休眠特性是导致其资源匮乏的主要原因，栗孟飞[20]研究表明桃儿七种子内含有的内源抑制物是导致其休眠产生的主要原因。而李城德等[21]的研究表明种皮和胚乳的限制以及生理后熟导致桃儿七种子休眠。虽然用GA3溶液浸种或低温层积均能一定程度上解除桃儿七种子休眠,但目前对于桃儿七种子层积过程中胚形态及生理生化物质动态变化的研究鲜见报道。因此，本研究通过对桃儿七种子进行低温层积处理，测定不同层积时间的种子胚形态及生理生化物质的动态变化，旨在探究桃儿七种子休眠解除与胚形态及生理生化物质之间的内在联系，为揭示桃儿七休眠机理提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

桃儿七[Sinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying]种子于2020年9月采于甘肃中医药大学和政药用植物园(35°15′48″N，103°24′21″E)，并由甘肃中医药大学杜弢教授鉴定确认，先经清水浸泡，揉搓后去掉果肉，再过筛剔除瘪粒，自然阴干，置于4 ℃冰箱储存备用。

1.2 种子低温层积处理

将河沙洗净过筛(40目)，高压灭菌锅灭菌(121 ℃，30 min)，铺至距容器底部3～4 cm处，将桃儿七种子装入纱布网袋平铺于河沙之上，再盖河沙至距容器底部6～8 cm处，保证种子处于容器中部，沙子湿度为9%～11%，用保鲜膜封住容器，打孔透气，将容器置于4 ℃冰箱中。以后每隔15 d定期取样，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 种子胚形态及胚率观测

从各层积时期种子中分别随机选取15粒，蒸馏水浸泡16 h，OCT胶水常温包埋10 min，冷冻包埋5 min(-20 ℃)，Leica-CM1950型恒冷切片机切片(厚0.15 mm)，先用1%番红溶液染色3 min，再用0.1%固绿醇溶液染色30 s，LeicaDM500显微镜观察种子形态结构，测量胚长和种子长，并用如下公式计算胚率：

胚率(%)=(胚长/种子长)×100%

1.4 种子生理生化指标测定

桃儿七种子淀粉含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、丙酮酸激酶(PK)活性、琥珀酸脱氢酶(SDH)活性均采用试剂盒(南京建成)测定，具体操作按试剂盒说明进行。6-磷酸-葡萄糖脱氢酶(G-6-PDH)活性、赤霉素(GA)含量、吲哚乙酸(IAA)含量、脱落酸(ABA)含量均采用ELISA酶联免疫法试剂盒(上海钦诚)测定，具体操作按试剂盒说明进行。

1.5 种子发芽率测定

随机选取各层积时期桃儿七种子150粒，用1%的NaClO消毒15 min，蒸馏水冲洗3～5次，播于沙床上(铺沙3～5 mm),每皿播种50粒，3次重复，在25 ℃全光照条件下培养，每天加水(1 mL)，记录萌发种子数(以胚根突破种皮为种子萌发标准)，用如下公式计算发芽率：

发芽率(%)=(发芽种子数/供试种子总数)×100%

1.6 数据分析

使用Origin2019作图, SPSS17.0进行方差及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 低温层积过程中桃儿七种子胚形态、胚率及发芽率变化特征

桃儿七种子胚形态在低温层积各时期均为鱼雷型胚或子叶型胚(图1)；桃儿七种子胚率在整个层积过程中总体呈上升趋势，且胚率在层积75 ～90 d期间增长迅速，并在层积90 d时达到最大值(34.44%)(图2，A)；桃儿七种子发芽率随着低温层积时间的延长总体呈上升趋势，在层积60 d后休眠开始解除，种子发芽率显著上升(P<0.05)，且在层积75 d时达到最大值(43.33%)(图2，B)。

A.鱼雷型胚；B.子叶型胚 图1 桃儿七种胚形态A. Torpedo embryo; B. Cotyledon embryoFig.1 Embryo morphology of Sinopodophyllum hexandrum

不同小写字母表示处理时间之间在0.05水平差异显著(P<0.05)；下同图2 不同层积时期桃儿七种子胚率及发芽率变化Different lowercase letters indicate that there are significant differences between treatment time points at 0.05 level (P<0.05)； The same as belowFig.2 Changes of embryo rate and germination rate of S. hexandrum seeds in different stratification periods

2.2 低温层积过程中桃儿七种子营养物质含量的变化特征

由图3可知，在低温层积过程中，桃儿七种子内淀粉含量总体呈现下降趋势，且在层积75～90 d期间下降最为迅速，层积90 d时的桃儿七种子内淀粉含量(2.08 mg/g)较处理前(47.89 mg/g)显著下降95.66%(P<0.05)；种子可溶性蛋白含量在层积前期(0～30 d)变化平缓，在层积30～60 d期间出现小幅的波动，在层积60 d后显著升高(P<0.05)，并在层积75 d达到最大值(69.26 mg/g)；种子可溶性糖含量在层积前期(0～30 d)显著下降(P<0.05)，并在30 d时达到最小值95.39 mg/g，此后平缓上升，至层积90 d时，其含量与初始含量基本持平。

图3 桃儿七种子层积过程中营养物质含量变化Fig.3 Changes of nutrient contents in seeds of S. hexandrum during seed stratification

2.3 低温层积过程中桃儿七种子呼吸途径关键酶活性变化特征

桃儿七种子呼吸途径关键酶丙酮酸激酶(PK)活性在整个层积过程中呈现持续下降趋势，在层积0～15 d活性下降显著(P<0.05)，此后变化平缓，并在层积90 d时降到最小值1.85 U/g(图4，A)；种子琥珀酸脱氢酶(SDH)活性在层积过程中总体呈下降趋势，并分别在层积30～45 d和60～75 d期间下降显著(P<0.05)(图4，B)；在整个层积过程中，种子6-磷酸-葡萄糖脱氢酶(G-6-PDH)活性在54.58～87.51 U/g范围内浮动且变化平缓，但在层积60～75 d之间活性显著升高(P<0.05)，而后又迅速下降至初始水平(图4，C)。

图4 桃儿七种子层积过程中呼吸途径关键酶活性变化Fig.4 Changes of key enzyme activities in respiratory pathway of S. hexandrum seeds during seed stratification

2.4 低温层积过程中桃儿七种子内源激素含量变化特征

桃儿七种子GA含量在低温层积前期(0～30 d)变化平缓且无显著差异(P<0.05)；在层积60～90 d期间，其含量迅速上升并达到最大值431.97 ng/g(图5，A)；种子IAA含量在整个层积过程中呈现阶梯式增长趋势，于层积0～15 d变化平稳，在层积15 d后迅速上升，且与前一时期差异显著(P<0.05)，此后小幅上升但无显著变化，至90 d时达到最大值108.76 ng/g(图5，A)；种子ABA含量在整个层积过程中变化幅度较小且差异不显著(P<0.05)，其含量在566.96～633.93 ng/g范围内小幅波动(图5，A)。另外，在低温层积过程中，桃儿七种子各内源激素含量间比值均呈波动上升趋势，并始终表现为GA+IAA/ABA最大，GA/ABA次之，IAA/ABA明显小于前两者，且变幅较小(图5，B)。

图5 桃儿七种子层积过程中内源激素含量及其比值的变化Fig.5 Changes of endogenous hormone contents and their ratios in seeds of S. hexandrum during stratification

2.5 桃儿七种子各指标间相关性分析

由表1可知，在桃儿七种子低温层积过程中，种子胚率和发芽率与其营养物质含量、呼吸途径关键酶活性、内源激素含量的18个相关系数中，数值绝对值达到0.5以上的有9个。其中，种子胚率与淀粉含量呈显著负相关关系(r=-0.785*)，但与其余指标相关关系均不显著(P>0.05)；发芽率与可溶性蛋白含量呈显著正相关关系(r=0.867*)，但与其余指标相关关系均不显著(P>0.05)。

表1 不同层积时期各指标间的相关性分析

3 讨 论

3.1 桃儿七种子休眠解除与种胚形态的关系

根据Baskin[22]对种子休眠的分类，种胚形态结构尚未分化或未发育完全被称为形态休眠。研究表明滇重楼种子成熟时胚发育不完整，存在形态休眠[23]。王晶等[24]研究发现朝鲜淫羊藿种子需经历形态后熟才能萌发。本研究结果表明桃儿七种胚虽然在层积过程中不断伸长发育，但均为鱼雷型胚或子叶型胚，胚形态成熟，不存在形态休眠。这与陈伟等[25]的研究结果一致。

3.2 桃儿七种子休眠解除与营养物质转化及呼吸代谢的关系

成熟种子内的淀粉在相关代谢酶的催化下逐步水解为可被利用的小分子物质，从而促进种子休眠的解除[26]，而种子中可溶性蛋白的含量间接反映着代谢活动的强弱，并为种子萌发提供充足的氮源，可溶性糖作为呼吸代谢的直接底物是种子中最直接的供能物质[27]。研究表明七叶树种子在层积过程中脂肪和淀粉的含量持续下降，可溶性蛋白质含量逐渐升高，从而导致休眠解除[28]；黄精种子在低温层积过程中其淀粉和粗脂肪逐步分解为可溶性糖及可溶性蛋白等小分子物质，为种胚的分化发育提供能量，从而促进黄精种子萌发[29]。本研究结果表明在低温层积过程中桃儿七种子内淀粉含量持续下降，可溶性蛋白含量逐渐升高，且可溶性蛋白含量与发芽率呈显著正相关(P<0.05)，说明桃儿七种子内淀粉可能通过淀粉酶的催化而进一步分解为葡萄糖等物质以用于供能；同时，种子可溶性糖含量在层积前期(0～30 d)出现显著下降(P<0.05)，可能是种子从休眠状态进入吸胀萌动阶段时，首先将胚部或胚轴中少量的可溶性糖分解用于生长的结果，而可溶性糖在层积后期的逐步升高可能与淀粉的持续分解有关。这与张成才等[30]对百蕊草种子研究结果一致。另外，桃儿七种子内可溶性蛋白在层积前期基本没有变化，但随着层积的不断进行，其含量出现显著上升(P<0.05)，这可能是层积后期种子完成生理后熟的过程中，种子内部生理代谢增强的原因。

氧化途径学说认为,种子休眠主要是受呼吸途径中的糖酵解途径(EMP)、三羧酸循环途径(TCA)和戊糖磷酸途径 (PPP) 的平衡调节[14]。杨艳华[31]对南京椴种子的研究表明，其胚乳内TCA途径关键酶MDH及PPP途径关键酶G-6-PD活性随休眠解除而呈上升趋势，并由此认为TCA和PPP途径的活化是种子休眠解除的关键。圆齿野鸦椿种子在低温层积过程中G-6-PDH和6-PGDH联合酶活性波动上升，PPP途径所占比例逐步升高，最终导致种子休眠解除[32]。本研究结果表明层积前后EMP途径关键限速酶PK活性及TCA途径关键限速酶SDH活性显著降低(P<0.05)，PPP途径关键酶G-6-PDH活性在层积后期(60 ～75 d)显著上升(P<0.05)，此阶段种子发芽率也显著上升(P<0.05)，说明桃儿七种子在休眠解除的过程中，种子内主要呼吸途径由EMP—TCA途径逐渐转向PPP途径，PPP途径的活化是种子休眠解除的关键因素。

3.3 桃儿七种子休眠解除与内源激素的关系

植物激素在种子休眠与萌发的过程中起着重要作用，种子内源激素的消长平衡调控着种子的休眠水平。GA被认为是萌发促进类物质，而ABA被认为是萌发抑制类物质[33]。有关IAA对种子萌发和休眠的影响存在一定的争议，有研究表明IAA具有释放种子休眠、促进种子萌发的作用[34]，但也有学者认为IAA与ABA存在协同作用从而作用于种子休眠的正向调节[35]。何超等[36]研究发现纳罗克非洲狗尾草种子在层积过程中ABA含量随休眠的解除而下降。三七种子中ABA含量随种子后熟过程而呈下降趋势，从而导致其休眠解除[37]。有学者认为破除种子休眠、促进萌发因素的不仅仅是内源激素绝对含量，而且还和萌发促进物和抑制物的比例有关[38]。研究表明在低温层积过程中徕木种子GA含量随层积时间的延长而逐渐增大，种子内GA/ABA增大有利于种子休眠解除和萌发[39]。赵迪等对露蕊乌头的研究也得出类似结果[34]。本研究结果表明，桃儿七种子ABA含量在整个层积过程中变化平缓且其含量在层积前后无显著差异(P<0.05)，而GA含量及IAA含量在层积后期显著升高，GA/ABA、IAA/ABA、(GA+IAA)/ABA的比值均在层积后期呈上升趋势，且IAA/ABA、(GA+IAA)/ABA的比值在层积前后出现显著上升(P<0.05)。说明IAA对解除桃儿七种子休眠具有正向调控作用，萌发促进物和抑制物比例(GA/ABA、IAA/ABA、GA+IAA/ABA)的升高及IAA含量的显著上升是桃儿七种子休眠解除的关键因素。