果袋类型对‘紫金红霞’葡萄果实品质及花色苷合成相关基因表达的影响

王西成，吴伟民，王 博，王壮伟，钱亚明，闫莉春

(江苏省农业科学院果树研究所，江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，南京 210014)

葡萄是一种重要的经济作物，在世界范围内广泛种植。中国是葡萄生产大国，葡萄栽培面积和产量分居世界第3和第1位[1]。色泽是果实外观品质的重要指标，更是葡萄果实成熟程度的重要评价依据，直接决定着葡萄的商品价值和市场竞争力。花色苷是一类广泛存在于植物体内的水溶性色素，是决定葡萄果实颜色的主要物质，可通过苯丙烷代谢途径和类黄酮途径合成，存在于表皮细胞的液泡中，伴随着葡萄果实的发育与成熟，果实中花色苷会逐渐积累，进而使葡萄呈现出不同的颜色[2-3]。

花色苷的合成不仅受遗传因素影响，同时还受到环境和理化因素的影响，如光照[4]、温度[5]、水分[6]、植物生长调节剂[7-8]等。遗传因素决定了花色苷合成的种类和时期，而环境因素则会影响花色苷生物合成的速率和积累量[9-10]。一般认为葡萄果实中花色苷的合成主要包括苯丙氨酸代谢、类黄酮代谢、二氢黄酮醇生成花色素、花色素骨架合成后的修饰，以及花色苷合成后在液泡内的转运和汇集5个阶段。而花色苷生物合成相关基因主要包括结构基因和调节基因，结构基因可编码直接与花色苷合成和转运贮藏相关的酶，如：苯丙氨酸裂解酶基因(PAL)、查尔酮合成酶基因(CHS)、查尔酮异构酶基因(CHI)、黄烷酮-3-羟化酶基因(F3H)、黄烷酮3′羟化酶基因(F3′H)、黄烷酮3′5′羟化酶基因(F3′5′H)、二氢黄酮醇还原酶基因(DFR)、无色花色素双加氧酶基因(LDOX)、3-O-类黄酮葡萄糖基转移酶基因(UFGT)、甲基转移酶基因(OMT)等[11]；调节基因可控制花色苷生物合成过程中相关结构基因的时空特异表达，进而影响花色苷生物合成的强度和模式，如：转录因子基因MYB、bHLH等[12-13]。在花色苷合成过程中，充足的光照可促进UFGT基因的上调表达，进而促进葡萄果皮中花色苷的合成；而遮光处理则会抑制UFGT基因的表达，并最终影响花色苷的合成[14]。MYB是调控花色苷合成的重要转录因子，可在葡萄果皮中特异性表达[13-14]。枝条环剥和ABA处理均可通过促进MYBA1和MYBA2转录因子基因的表达，进而调控UFGT基因的上调表达，诱导花色苷的积累[15-16]。同时，MYB也可通过与bHLH互作来实现对果实花色苷合成的调控[17]。

套袋是优质葡萄生产过程中的一个关键环节，它不仅可以防止昆虫、鸟类等对果实的危害，同时还可有效阻碍病菌的侵染，大幅降低病果发生几率[18]。同时，套袋还能避免灰尘、农药等对果实的污染，保持果面的清洁和果粉的完整，有利于果实外观品质的提高[19]。此外，由于套袋改变了果实生长发育期的温度和光照条件，因此也会对果实的产量和内在品质产生一定的影响[20-21]。

目前，有关套袋对葡萄果实着色影响的研究尽管已有报道，但其影响果实着色的深层机理仍不清楚[22-23]。为进一步明确果实套袋对葡萄果实中花色苷合成及相关基因表达的影响，本研究以‘紫金红霞’葡萄为试材，考察5种不同类型果袋对果皮中花色苷合成及相关基因表达影响，以期在转录水平上探讨套袋影响葡萄花色苷合成的分子机理，同时也为‘紫金红霞’葡萄生产中果袋的选择提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于2020年6-8月在江苏省农业科学院溧水植物科学基地内进行。供试材料为长势基本一致的3年生‘紫金红霞’葡萄，常规栽培管理。供试果袋包括白色纸袋、无纺布-白纸双层袋(双层袋)、绿色纸袋、蓝色纸袋和棕色纸袋。

1.2 材料处理与样品采集

2020年6月12日，选取生长发育相对较为一致的葡萄进行5种果袋套袋处理，不套袋为对照(CK)。试验设置3次生物学重复，单株小区，每个处理3株葡萄。分别于套袋后40、50和60 d时各取样一次，直至果实完全成熟。每次从每个小区葡萄果穗的上、中、下部位随机取样20粒。样品采集后分两部分保存，一部分冰盒带回实验室，用于单果重、果粒纵横径、可溶性固形物(total soluble solid, TSS)、可滴定酸(titrate acid, TA)、花色苷含量，以及果实色泽指标的测定；另一部分用手术刀片剥取果皮，液氮速冻后转移至-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3 果实品质测定

单果重量用电子天平称量，果实的纵径和横径用游标卡尺测量，据此计算果形指数(纵径与横径的比值)。可溶性固形物含量采用PAL-1手持式糖度计(ATAGO)测定，可滴定酸含量采用酸碱滴定法测定。葡萄果实赤道(中纬线)处对称4面的果面色泽采用Color Quest XT色差计Hunter Lab表色系统进行测定[24]，主要包括L*(亮度)、a*(红绿色差)、b*(黄蓝色差)。然后，进一步利用色差计所测值计算出色泽饱和度(chroma，C*)、色调角(hue angle,h°)和葡萄果实色泽指数(color index of red grape,CIRG)。其中，C*=(a*2+b*2)1/2，h°=arctan(b*/a*)，CIRG=(180-h°)/(L*+C*)。葡萄果实色泽指数评价果实色泽的标准为：CIRG<2 为黄绿色，26为紫黑色[25]。

1.4 花色苷含量测定

果皮总花色苷的提取参考Jia等[26]的方法并加以改进：分别取不同发育时期、不同处理的果皮样品，液氮研磨成粉末，称取1.0 g样品粉末，加入10 mL含1%盐酸的甲醇溶液，4 ℃黑暗条件中静置24 h，10 000 r/min高速离心10 min，沉淀反复浸提3次，合并上清液即得果皮总花色苷提取液。花色苷含量的测定参考王小青等[27]的方法进行，首先利用分光光度计分别测出530和650 nm处的吸光度值D530和D650，然后根据公式计算出葡萄果皮中花色苷含量。其中，花色苷含量(mg·g-1)=(D530-0.25×D650)×提取液总体积/0.0462/果皮鲜重。

1.5 基因表达分析

本研究选择了部分花色苷合成相关基因用于表达分析。总RNA的提取采用上海浦迪生物科技有限公司生产的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒进行，操作方法参考说明书进行，并利用琼脂糖凝胶电泳对RNA质量进行检测。以总RNA为模板，利用MonScriptTMRTⅢ All-in-One Mix with dsDNase试剂盒反转录合成cDNA。

Real-Time PCR引物设计：MYBA1和CHS1基因引物参考张雷等[22]，F3′H、DFR和LDOX基因引物参考Jeong等[28]，UFGT基因引物参考柳巧禛等[29]，内参基因KyActin1引物参考Kobayashi等[12]，引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成(表1)。

Real-Time PCR反应体系为20 μL：MonAmpTMSYBR Green qPCR Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，上游和下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。反应程序为两步法：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火+延伸30 s，40个循环。每个循环第2步进行荧光数据读取。每个样品设置3 次重复，相关数据采用2-ΔΔCT法进行处理，以确定目的基因的相对表达水平。

1.6 数据分析

数据平均值、标准差、标准曲线等利用Excel 2016软件进行计算，单因素方差分析使用SPSS 25.0统计软件完成。

2 结果与分析

2.1 果袋类型对葡萄果实品质的影响

由表2可知，随着葡萄果实的发育与成熟，各套袋处理和对照葡萄果实的单果重、纵横径和可溶性固形物含量均在逐步增加，而可滴定酸含量则呈逐步下降趋势。与同期对照相比，套袋处理在多数时期并未对果实单果重、纵横径和果形指数产生较大影响，但随着果实的生长发育，不同类型果袋却对果实TSS和TA含量产生了不同程度的影响。其中，套袋40 d时，各色果袋处理果实中TSS含量与对照相比均无显著变化；在套袋50 d时，其TSS含量在白色袋、双层袋和绿色袋处理下与对照相比仍无显著变化，而在蓝色和棕色果袋处理下显著降低；在成熟期(套袋后60 d)时，双层袋、绿色袋处理TSS含量与对照还无显著差异，而在白色袋、蓝色和棕色袋处理下均比对照显著降低，并以蓝色袋降幅最大(19.17%)；而无纺布-白纸双层果袋和绿色纸袋则未对TSS含量产生较大影响。果实TA含量在白色袋、绿色和棕色袋处理40 d，以及双层袋处理50 d时均比同期对照显著降低，其余套袋处理均与同期对照无显著差异；在果实完全成熟时(套袋后60 d)，蓝色纸袋处理果实中TA含量显著高于对照，其他果袋处理均未对TA含量产生显著影响。

表2 不同类型果袋处理下葡萄果实品质的变化

2.2 果袋类型对葡萄果实色泽及总花色苷含量的影响

表3显示，随着葡萄果实的发育成熟，套袋处理和对照果实的L*值和b*值整体呈逐渐下降趋势，而a*值和CIRG值则呈逐步升高趋势。与对照相比，各取样时期套袋果实L*值和b*值均高于同期对照，且大多达到显著水平；与之相反，各取样时期套袋果实a*值和CIRG值则均低于同期对照，且CIRG值的变化在各时期均达到显著水平。总体而言，‘紫金红霞’葡萄套袋处理有助于果皮亮度L*和黄蓝色差b*值的提高，但却降低了红绿色差a*值和果实色泽指数CIRG。尽管套袋处理不利于CIRG值的增加，但不同类型果袋间处理也存在一定差异，其中对CIRG值影响较小的为无纺布-白纸双层果袋、绿色纸袋和白色纸袋，而蓝色纸袋和棕色纸袋则对CIRG值影响较大。

表3 不同类型果袋处理下对葡萄果实色泽的变化

为进一步明确不同类型果袋对‘紫金红霞’葡萄果实着色的影响，本研究对不同处理果皮中的总花色苷含量进行了测定分析。由图1可知，随着葡萄果实发育成熟，套袋处理和对照果皮中总花色苷含量总体均呈逐步增加趋势。其中，在套袋后40～50 d时，套袋处理果皮中总花色苷含量均显著低于对照，并以蓝色和棕色果袋处理果皮中花色苷含量最低；在果实完全成熟时(套袋后60 d)，除无纺布-白纸双层袋处理果皮总花色苷含量与对照样品之间无显著差异外，其他套袋处理均比对照显著降低，显著抑制了果皮中花色苷的合成。

图1 不同类型果袋处理下葡萄果皮中总花色苷含量的变化Fig.1 The total anthocyanin content in grape skin under different types of fruit bagging

2.3 果袋类型对葡萄果皮中花色苷合成相关基因表达的影响

qRT-PCR分析结果(图2)表明，在葡萄果实发育后期(套袋后40、50和60 d)，套袋处理对果皮中花色苷合成相关基因的表达主要表现为抑制作用。在套袋后40和50 d时，除白色纸袋在套袋后40 d时促进了MYBA1基因的上调表达外，其他套袋处理对于相关基因的表达主要表现为抑制作用。在套袋后60 d时，不同类型果袋对果皮中花色苷合成相关基因表达的影响差异较大，其中，白色纸袋促进了MYBA1、DFR和LDOX基因的上调表达，无纺布-白纸双层果袋则对F3′H和UFGT基因的表达产生了促进作用，而绿色、蓝色和棕色果袋对于相关基因的表达仍表现为抑制作用。

图2 不同类型果袋处理下转录因子及花色苷合成相关基因表达的变化Fig.2 The expression of transcription factors and anthocyanin synthesis related genes under different types of fruit bagbing

3 讨 论

果实套袋是果树生产中常用的一种栽培管理技术，由于果实套袋后其生长的微环境发生了变化，因此会对果实生长发育特性和果实品质产生一定的影响。果实色泽与果面光洁度是葡萄外观品质的重要指标，生产中常通过果实套袋技术来提高葡萄的外观品质。然而，不同类型的果袋其效果也存在较大的差异，生产中常根据葡萄品种的具体特点来选择使用不同类型的果袋[30]。

本研究发现，与对照相比，尽管在‘紫金红霞’葡萄果实发育过程中不同套袋处理会对果实品质相关指标产生不同程度的影响，但到果实完全成熟时，除白色、蓝色和棕色果袋抑制了果实中可溶性固形物含量的增高，蓝色果袋阻碍了果实中可滴定酸含量的降低外，套袋处理并未对果实的单果重、纵横径、果形指数等产生显著影响，这说明套袋不利于‘紫金红霞’葡萄果实内在品质的提升，但对果实大小和形状并不会产生较大的影响[31-32]。

在花色苷含量方面，5种果袋均对‘紫金红霞’葡萄花色苷的合成产生了一定的影响，其中蓝色和棕色果袋对成熟期果实中总花色苷合成的影响最为显著，其次是白色和绿色果袋，而无纺布-白纸双层袋则未对成熟期葡萄果皮中的总花色苷含量产生显著影响。这与果实色泽分析中，套袋处理果面亮度指标L*和黄蓝色差指标b*值多显著高于对照，而红绿色差a*值和色泽指数CIRG值多显著低于对照的研究结果是一致的。究其原因可能在于光照是影响果实着色的重要因素，充足的光照可通过光合作用为花色苷的合成提供所需的底物，进而促进花色苷的合成[33-34]。但由于蓝色和棕色果袋透光率偏差，白色和绿色果袋透光率稍强，使得不同类型果袋对葡萄果皮中花色苷的合成产生了不同的影响；无纺布-白纸双层袋未对成熟期果皮中花色苷含量产生显著影响的原因，可能与果袋透光率和袋内温度双重环境因素的变化有关。

花色苷的合成与积累受多个转录因子和结构基因的协同调控。已有研究表明，MYBA类转录因子与果皮中花色苷合成密切相关[8, 35]，CHS、F3H、DFR、LDOX、UFGT等结构基因也在调控果实着色方面发挥着重要的作用[22, 36]。本研究发现，在葡萄果实生长发育后期(套袋后40～60 d)，除白色纸袋外，其他果袋对MYBA1基因的表达主要表现为抑制作用，这与其他果树上的研究结果较为相似[37-38]；对于结构基因而言，除套袋处理60 d时白色纸袋促进了DFR和LDOX基因的上调表达、无纺布-白纸双层袋促进了F3′H、DFR和UFGT的上调表达外，其他处理对于果实发育后期相关基因的表达主要表现为抑制作用，这与总花色苷含量的测定结果基本吻合。尤其对于无纺布-白纸双层袋而言，成熟期果皮中花色苷含量与对照间并不存在显著差异，这可能与F3′H、DFR和UFGT三个基因在处理果皮中的上调表达有关。

综上所述，套袋处理未对‘紫金红霞’葡萄果实单果重和果型指数产生显著影响，但不利于果实可溶性固形物含量和果实色泽指数的提高；不同类型果袋可通过抑制花色苷合成相关基因的表达，进而阻碍果皮中花色苷的合成。套袋处理虽对果实内在品质和着色产生了一定的不利影响，但却有利于果面光洁度和整体外观品质的提高。综合分析认为由于无纺布-白纸双层袋对成熟期果实综合品质影响最小，因此可作为‘紫金红霞’葡萄套袋的优先选择；其次是白色和绿色纸袋；而由于蓝色和棕色果袋对果实综合品质产生了较大的不利影响，因此不适用于该品种果实套袋。