皂荚刺发育过程中形态与结构观察研究

孙娅楠，赵 杨*，何可权，陆跃堂

(1 贵州大学 林学院，贵州省森林资源与环境研究中心，贵阳 550025；2 独山县国有林场，贵州独山 558200)

皂荚(GleditsiasinensisLam.)隶属于豆科(Leguminosae)云实亚科(Caesalpinioideae)皂荚属(Gleditsia)，又名皂角、猪牙皂等[1]，是中国生态经济型乡土树种。其一身均是宝，具有食用[2]、药用[3]、化工[4]和观赏[5]等价值，且还在美容、洗发水和用材等方面发挥着作用。皂荚刺是皂荚的主要药用部位，其富含黄酮类、三萜皂苷类等药用成分，具有消除炎症、抗肿瘤等作用，被誉为“十大抗癌草药”之一[6]。

皂荚刺的研究主要集中在皂荚刺的药用价值方面[7]，而在皂荚刺发育方面的研究鲜有报道，其中李建军等[8]和陈思等[9]对皂荚刺的物候期进行观测，简单地描述其形态变化。皂荚刺发育过程及机理不清，影响了皂荚刺用遗传改良与定向栽培，故本研究以皂荚实生苗为研究材料，通过外部形态对应内部结构的方法，以揭示皂荚刺发育过程的形态学变化，为皂荚刺用遗传改良与定向栽培奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试验设计

本研究试验地位于贵州大学林学院基地，地处106°39′27″E，26°27′13″N，海拔1 082 m，为亚热带湿润温和型气候，年均温15.3 ℃，年平均降水量约1 130 mm左右。2019年底于贵州省贵阳市采集皂荚种子，2020年6月开始对皂荚种子进行催芽处理(通过浓硫酸处理30 min，38 ℃水浴浸泡24 h)，种子露白后移苗，即选用健康状况良好的皂荚苗木进行试验，以混合土(黄壤∶蛭石∶珍珠岩=6∶1∶1)作为栽培基质，花盆规格为20 cm×20 cm，每盆定植一株苗，盆栽完成后统一进行浇水、除草等苗期管理。对皂荚刺芽发育进行为期6个月的观测，前期为每天观察一次，后期为半个月观察一次，并及时做好皂荚刺外观形态与石蜡切片的拍照记录及测定。

1.2 指标测定

1.2.1 皂荚刺生物量与含水量测定各时期分别选取30株长势良好、无病害、能代表平均水平的皂荚幼苗，将当天采回来的皂荚苗鲜样带回实验室，在105 ℃烘箱中杀青30 min，之后60 ℃烘箱继续烘至恒重，即可称其干重为生物量，并计算皂荚刺的分配比和含水量，皂荚刺分配比(%)=刺干重/单株干重，皂荚刺含水量(%)=(刺鲜重-刺干重)/刺鲜重。

1.2.2 皂荚芽/刺扫描电镜、体视显微镜观察各时期将当天采回来的芽鲜样带回实验室，用Hitachi TM4000 plus扫描电镜和Leica M205FA显微镜观察10株皂荚刺的外部形态变化，并做好拍照记录，利用Image J软件测定皂荚刺形成后的单株刺数量、刺分叉数、刺基径、刺长等指标。

1.2.3 皂荚芽/刺石蜡切片观察各时期将10株现采的皂荚芽/刺鲜样去掉其叶片，保留完整的腋芽立即放入FAA固定液(50%乙醇∶甲醛∶冰乙酸∶甘油=18∶1∶1∶1)中固定，皂荚刺木质硬化后则选用同比例70%乙醇的FAA固定液固定，然后采用石蜡切片法制成永久性切片，石蜡切片染色采用番红-固绿染色[10]，之后在Leica DM3000显微镜下进行解剖学观察且拍照记录，同样利用Image J软件测量髓、木质部、韧皮部的宽度等指标。

1.3 数据分析

利用Excel 2010对测量数据进行统计整理，采用SPSS 18.0进行数据统计分析，采用单因素方差分析、多重比较(P<0.05)进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 皂荚幼苗的生长发育过程

图1为未催芽处理当天(0 d)以及1～14 d皂荚幼苗的外部形态。未催芽处理的种子有坚硬的种壳，种胚颜色为黄色(图2，A)；催芽处理1 d后皂荚种子吸胀，种胚颜色由原来的黄色变为黄绿色，且质感由原来的干瘪变为水润的肉质状(图2，B)；2 d皂荚种子露白，种胚大小变化不明显(图2，C)；3 d皂荚种子出土，种胚形态整体膨大，上胚轴明显向上延伸(图2，D)；4 d皂荚的下胚轴和上胚轴继续向上延伸(图2，E)；6 d种子脱掉种壳，种胚中幼叶的下半部颜色由原来的黄绿色变为绿色，幼叶较前期更为趋于成熟(图2，F)；7 d皂荚幼苗张开子叶，肉眼能在叶腋处看见一个小凸起的腋芽(图2，G)；8 d上胚轴继续向上延伸，节间距离变大，子叶向两侧更为张开，叶腋处的腋芽逐渐膨大变得更为明显(图2，H)；14 d肉眼能清楚地看见皂荚刺的形态，可以确定皂荚刺着生的位置为皂荚苗的叶腋处(图2，I)；30 d皂荚幼苗节间距离基本固定(图2，J)；75 d皂荚刺颜色逐渐变黄(图2，K)；165 d皂荚幼苗的叶片脱落，皂荚刺变为红褐色(图2，L)。

图中为未催芽处理当天(0 d)以及1-14 d皂荚幼苗的外部形态图1 皂荚生长过程中的外部形态The figure shows the external morphology of G. sinensis seedlings on the day without bud forcing treatment(0 d) and 1-14 dFig.1 External morphology of G. sinensis development process

A.未催芽处理当天(0 d)；B-L.分别为催芽处理后1、2、3、4、6、7、8、14、30、75和165 d皂荚叶腋处的外部形态图2 皂荚刺生长过程中的局部形态A. The day without bud forcing treatment(0 d)； B-L. The external morphology of G. sinensis axillary on after bud forcing treatment 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 14, 30, 75 and 165 dFig.2 Local morphology of G. sinensis thorn development process

2.2 皂荚刺发育过程的形态学变化

皂荚在种子状态下未见刺芽(图3，A)，而是在催芽处理3 d时才发现皂荚刺原基，且其为一个裸芽，没有鳞叶包裹，呈扁平、肉质状(图3，B)；4 d皂荚刺芽整体不再呈扁平状，出现明显的膨大(图3，C)；5 d能看见两端有两个“小凸起”，整体呈小山状(图3，D)；6 d 皂荚刺芽两端的凸起更为明显(图3，E)；7 d观察到之前的“小凸起”继续向上延伸，皂荚刺芽顶部出现裂开的迹象(图3，F)；8 d后“小凸起”发育为鳞叶，形成2枚外部的已完全分离的鳞叶，并出现明显的主径(图3，G)；9 d观察到皂荚刺侧枝发育的“小凸起”，皂荚刺芽开始抽梢，径向生长更快(图3，H)；14 d皂荚刺的基本结构发育完全，其分枝数已固定，且皂荚刺分枝时均会发育1枚鳞叶，此时的皂荚刺及其鳞叶仍呈肉质状(图3，I)；30 d皂荚刺开始木质硬化(图3，J)；75 d皂荚刺的颜色开始变为黄褐色(图3，K)；165 d皂荚刺颜色完全变为红褐色(图3，L)。

A-H分别为催芽处理2-9 d皂荚刺的外部形态，I-L分别为14、30、75和165 d皂荚刺的外部形态图3 皂荚刺发育过程中的外部形态A-H are the external morphology of G. sinensis thorn on 2-9 d with bud forcing treatment, I-L are the external morphology of G. sinensis thorn on 14, 30, 75 and 165 dFig.3 External morphology of Gleditsia sinensis thorn development process

由表1可知，皂荚刺发育过程中刺的外部形态整体呈上升趋势，且各时期间差异显著(P<0.05)。其中皂荚单株刺数量和分枝数均在皂荚刺开始木质化后增长迅速，增长率分别为204.54%、31.09%，在刺完全褐化时，达到最大值；而皂荚刺的单刺基径则是在刺开始褐化以后的增长最为迅速，增长率为54.37%，分别是前3个时期的3.32、1.89、1.54倍；且皂荚刺的单刺总长则在刺基本结构形成后增长最为迅速，其增长率为254.67%。

表1 皂荚刺发育过程中外部形态的变化

2.3 皂荚刺发育过程的解剖学变化

皂荚幼苗出土前，尚未发现皂荚刺腋芽原基，但能观察到皂荚幼叶的小叶原基(图4，A)；3 d观察到皂荚刺腋芽原基，其与皂荚幼苗茎段的维管束相连，根据细胞组织分区学说，其AM由体积较大且呈圆顶状的CZ、体积较小且胞质致密的PZ及沿轴向呈明显纵向排列的RM所组成，顶状结构的顶端为CZ，在CZ区的周围环绕着PZ，OC维护着CZ，OC的下方是RM(图4，B-C)；4 d CZ的细胞通过垂周分裂，产生表皮，然后通过其侧面和基部细胞的分裂，产生PZ的内层及RM，促使皂荚刺腋芽整体膨大(图4，D)；5 d PZ细胞持续分裂，产生鳞叶原基P (图4，E)；7 d皂荚刺芽鳞叶发育已基本完成，有开裂的迹象(图4，F)；8 d鳞叶发育完全，已成型，皂荚刺主轴向上延伸(图4，J)；9 d PZ细胞持续平周分裂，产生侧枝原基BP(图4，H)；10 d PZ细胞继续分裂分化，再次产生另一个侧枝原基，皂荚刺腋芽径向生长变化显著(图4，I)。

A和B-C分别为催芽处理2 d和3 d皂荚刺解剖结构的纵切面，D-I分别为4、5、7、8、9和10 d皂荚刺解剖结构的纵切面；AM.腋生分生组织；P.叶原基；VB.维管束；CZ.中央区母细胞区；RM.肋状分生组织区；PZ.周缘分生组织区；OC.中央组织中心；Ca.鳞叶；BP.侧枝原基图4 皂荚刺发育过程中的解剖结构变化A and B-C are longitudinal sections of the anatomical structure of G. sinensis thorn with bud forcing treatment 2 d and 3 d. D-I are longitudinal sections of the anatomical structure of G. sinensis thorn with 4, 5, 7, 8, 9 and 10 d; AM. Axillary meristem; P. Phyllopodium; VB. Vascular bundle; CZ. Central zone; RM. Rib meristem; PZ. Peripheral zone; OC. Organizing center; Ca. Cataphyll; BP. Branch primordiaFig.4 Changes in the anatomical structure of G. sinensis thorn development process

皂荚刺的结构均呈近似椭圆形，在刺基本结构形成时期，皂荚刺已经分化表皮、皮层、韧皮部、木质部、髓等组织结构，且在木质部中观察到环纹导管(图5，A-B)；之后原形成层向外形成韧皮部，向内形成木质部，韧皮部和木质部生长变化显著(图5，C-D)；此后木质部和韧皮部持续生长，两者相比，木质部的生长速度大于韧皮部(图5，E-H)。

如表2所示，随着皂荚幼苗的生长，皂荚刺的髓、木质部、韧皮部宽度整体均呈上升趋势，且各时期间差异显著(P<0.05)。其中皂荚刺的髓宽度在刺开始木质化之前虽有差别，但尚未达到差异水平，在刺完全褐化期的增长率最大，达到47.62%；木质部宽度同样在刺完全褐化期的增长率最大，达到282.24%，分别是其他3个时期的9.96、4.69和3.82倍；而皂荚刺的韧皮部宽度则在刺基本结构形成后增长率最大，达到106.32%，而此后的增长率只有22.27%、7.13%。

表2 皂荚刺发育过程中维管柱的变化

2.4 皂荚刺发育过程的生物量变化

由表3可知，在皂荚刺的生长进程中，皂荚幼苗的单株刺生物量和刺分配比整体均呈上升趋势，而刺含水量则呈下降趋势，各时期间差异显著(P<0.05)。其中皂荚刺生物量在刺开始木质化前的时期差异不显著，而在刺开始木质化之后生长迅速，是其他3个时期的94.71、10.67和0.83倍；皂荚刺的分配比同样在刺开始木质化之后生长迅速，增长率为89.86%，在刺完全褐化时达到最大值；而皂荚刺的含水量在刺基本结构形成时达到最大值，之后开始下降，在刺开始褐化后迅速下降，下降率为73.82%，在刺完全褐化时达到最小值。

表3 皂荚刺发育过程中生物量和含水量的变化

3 讨 论

芽是枝、花或花序的雏体，可根据芽在枝条上的着生位置、将发育成的器官性质、芽鳞的有无、生理活动的状态，分别分为定芽和不定芽，叶芽，花芽和混合芽，裸芽和被芽，活动芽和休眠芽等类型[11]。本研究中，皂荚刺芽是催芽处理3 d才在扫描电镜下观察到皂荚刺的芽原基，而皂荚刺芽的着生位置为皂荚幼苗的叶腋内，为腋芽或侧芽，故皂荚刺芽为定芽；并皂荚刺芽将发育成变态的枝条，故为叶芽；且根据在扫描电镜下观察到的皂荚刺原基，其为一个裸芽，无芽鳞包被；皂荚刺芽在生长季能形成变态的枝条，故当年由种子萌发的皂荚幼苗，其刺芽为活动芽。

茎端分生组织(SAM)位于植物嫩枝的尖端，是植物地上部分器官的来源。本研究中皂荚刺芽的腋生分生组织与顶芽茎尖分生组织结构相类似，根据细胞组织分区学说，可将SAM分为中心区(CZ)、周边区(PZ)和肋状区(RM)[12]。皂荚刺芽AM由体积较大且呈圆顶状的CZ、体积较小且胞质致密的PZ和沿轴向呈明显纵向排列的RM所组成，PZ是器官原基发生的起点，不断分化成新的鳞叶，且干细胞组织中心(OC)维护着CZ，RM在茎的伸长过程中起作用[13]。

植物茎结构分为表皮、皮层和维管柱3部分，而维管柱又分为维管束、髓和髓射线等部分，不同植物间茎初生结构的组成结构形状存在着一定的差异，或各结构所占大小存在差异。如萨如拉等[14]对2个苜蓿品种营养器官解剖结构特征研究发现，2个苜蓿品种的茎结构组成相同，均为表皮、皮层、维管束、髓等部分组成，但与‘草原2号’杂花苜蓿相比，‘草原4号’紫花苜蓿茎部厚角组织增厚，韧皮部向两侧延伸，具有变窄现象。马一鸣等[15]研究亚洲百里香、薄荷、黄芩、并头黄芩等6种唇形科植物茎的解剖结构，发现其茎均是四棱形，横切面近长方形，4个棱角处均有丰富的厚角组织，起着支持作用。本研究中，皂荚刺结构呈椭圆形，在刺基本结构形成时期，皂荚刺已经分化表皮、皮层、韧皮部、木质部、髓等结构，且在木质部中观察到环纹导管，之后形成层向外形成韧皮部，向内形成木质部，此后茎结构均持续生长，其中木质部生长速度大于韧皮部，促进皂荚刺的生长。

综上所述，本研究明确皂荚刺是由腋生分生组织发育而来，其发育过程与枝条的发育相似，皂荚刺芽分生组织由体积较大且呈圆顶状的中央区母细胞区、体积较小且胞质致密的周缘分生组织区和沿轴向呈明显纵向排列的肋状分生组织区所组成，同时将皂荚刺发育过程划分为8个时期，本研究为皂荚的开发利用与定向栽培提供理论依据和技术指导。