木薯块根膨大期韧皮部和木质部比较蛋白组学初步研究

王力敏　王东阳　王丹　王海燕　王红岩　王雪君　王斌　王旭初

摘 要 以‘华南8号木薯块根膨大期的韧皮部和木质部为材料，采用改进酚抽法提取总蛋白，进行一维和二维电泳，电泳图谱经Image Master分析，得到差异蛋白点进行质谱鉴定。结果表明：改进酚抽法可以从木薯块根韧皮部和木质部中提取高质量总蛋白，用于蛋白质组学研究；获得分离性好、分辨率及重复性较高的双向电泳图谱；比较木薯块根韧皮部和木质部双向电泳图谱发现265个差异表达蛋白点，其中29个在韧皮部特异表达，17个在木质部特异表达；成功鉴定出8种差异蛋白，这些蛋白主要参与翻译后修饰、无机离子和氨基酸转运代谢、分子伴侣和信号转导等代谢通路。本研究初步比较木薯块根韧皮部和木质部的蛋白表达差异性，为进一步从蛋白质组水平研究木薯块根膨大过程中淀粉转运、积累和合成调控机制奠定了技术基础。

关键词 木薯；块根；韧皮部；木质部；比较蛋白质组学；质谱分析

中图分类号 S533 文献标识码 A

木薯（Manihot esculenta Crantz）是多年生热带亚热带淀粉作物，木薯块根为其主要营养贮藏器官，淀粉含量高达40%，是南美洲、非洲、亚洲发展中国家重要的粮食来源[1-2]。除食用外，木薯淀粉还可以用作生产变性淀粉、酒精、山梨醇等工业原料，用途十分广泛[3]。鉴于其巨大的经济价值，提高木薯产量及淀粉含量便成为各国木薯基础研究的重要目标。

木薯块根淀粉合成和调控机制已在生理和基因工程方面取得了一定的研究进展。研究人员对木薯块根发育及淀粉积累做了一些生理方面的研究[4-5]，并运用基因工程手段来改变木薯根部淀粉合成相关基因如AGPase、SBE等的表达水平[6-8]，对块根中一些淀粉积累相关基因做了初步研究[9-10]。但在蛋白质组水平上的研究报道相对较少。有少数研究者对木薯根部的蛋白表达做了初步研究，如Sheffield等[11]对木薯的块根和须根做了比较蛋白组学分析；Li等[12]利用液相色谱-电喷雾串联质谱技术（LC-ESI-MS/MS）从华南8号（SC8）木薯体细胞胚胎、幼苗和块根组织中分离鉴定出383种蛋白，并对已鉴定蛋白的功能分类和组织特异性进行分析，为从“组学”方法上大规模、系统性研究木薯提供了借鉴；施涯邻等[13]对木薯根、茎、叶组织的蛋白提取方法进行改进，将SDS提取法和TCA-丙酮法相结合可以制备出适合双向电泳的蛋白样品。目前，有关木薯的蛋白质组学的研究主要集中在不同组织器官上，而对木薯块根韧皮部和木质部进行细致的比较蛋白质组学研究则鲜有报道。

在高等植物中，韧皮部含有筛管和伴胞复合体，担任着从“源”（如叶片等）到“库”（如块根、种子等）运输光合产物的重要作用，而木质部中含有大量的薄壁细胞，起着贮藏淀粉等营养物质的作用[14-15]。木薯块根是由纤维状须根膨大发育形成，淀粉主要积累在其膨大的块根木质部中。在块根膨大过程中，木薯地上部分形成的光合产物，由韧皮部运输到根部，经过卸载转运及淀粉再合成贮藏在薄壁细胞中。块根的韧皮部和木质部在此过程起着不同的作用，前者涉及光合产物的卸载和转运，而后者则涉及淀粉再合成和贮藏积累。刘斌[16]对木薯块根蔗糖卸载相关酶进行研究，发现细胞壁酸性转化酶（CWI）在质外体卸载中起着关键作用。在块根膨大后期，木质部CWI活性和表达量较高，韧皮部则在膨大前期较高，且高淀粉品种CWI蛋白的表达量整体要高于低淀粉品种。光合产物从“源”到“库”的运输和贮藏是一个复杂的、协调的系统，对于木薯根部同化物如何卸载转运、淀粉高效积累贮藏以及整个生物学过程涉及的信号转导机制，目前还不是很清楚。本研究以华南8号（SC8）木薯膨大期块根韧皮部及木质部为材料，采用改进酚抽法尽量减少块根中多糖类和其他杂质成分的干扰，以便提取到高质量蛋白，系统建立木薯块根韧皮部及木质部蛋白质组学技术体系，为进一步通过比较蛋白质组学方法揭示木薯块根发育和淀粉积累的调控机制提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 SC8木薯种茎由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供。当年3月中旬扦插种植，正常生长5个月左右，选取生长健壮植株，采集粗壮的木薯块根，清洗干净后切取块根中间段，剥离块根韧皮部和木质部（图1，A～D），液氮速冻，-80 ℃保存备用。

1.1.2 试剂 BPP法蛋白提取缓冲液：100 mmol/L Tris， 100 mmol/L EDTA， 50 mmol/L硼砂， 50 mmol/L 维生素C， 1% PVPP（W/V）， 1% Triton X-100（V/V），2% β-巯基乙醇（V/V）和30%蔗糖（W/V）， pH 8.0；蛋白裂解液： 7 mol/L 尿素， 2 mol/L 硫脲， 2% CHAPS（W/V）， 13 mmol/L DTT， 1% IPG buffer（V/V）；标准Laemmli buffer：62.5 mmol/L Tris-HCl ，2% SDS（W/V）， 10% 甘油， 5 % -巯基乙醇（V/V）， 0.001% 溴酚蓝（W/V）；胶条平衡液： 50 mmol/L Tris-HCl， 6 mol/L尿素， 30% 甘油（V/V）， 2% SDS（W/V），0.002%溴酚蓝（W/V）； GAP凝胶染色液： 0.125%考马斯亮蓝G-250（W/V）， 10% 硫酸铵（W/V）， 5%磷酸（V/V）， 30%（V/V）乙醇 ， 10% 甲醇（V/V）； 凝胶脱色液： 30%乙醇（V/V）， 5%乙酸（V/V）； 酶缓冲液： 1 mmol/L 氯化钙， 25 mmol/L 碳酸氢铵， pH 8.5。

1.2 方法

1.2.1 蛋白提取 基于酚抽法[17]改进的BPP法，具体参考Wang等[18]操作步骤。

1.2.2 蛋白定量 采用Bradford方法[19]，每个样品至少重复3次。

1.2.3 SDS-PAGE凝胶电泳 使用不连续胶SDS-PAGE法[20]，浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为12.5%，每孔上样量约为30 μg，与Laemmli buffer等体积混匀后上样。电泳条件为16 ℃恒温电泳3 h左右，参数设置为3 W/gel 50 min，6 W/gel 2 h。

二维凝胶电泳（2-DE）：2-DE蛋白上样量约为1 000 μg，上样总体积为455 μL。蛋白样品在水化盘内使24 cm的pH 4-7线性IPG干胶条被动吸胀，水化16 h左右。等电聚焦程序设定为：250 V，3 h；500 V，2 h；1 000 V，1 h； 10 000 V，3 h；10 000 V，130 000 Vhr。聚焦结束后，用含1% DTT的平衡液和含4%碘乙酰胺的平衡液各平衡胶条15 min，平衡结束后在Ettan Daltsix电泳仪（GE Healthcare）中进行第二向SDS- PAGE，16 ℃恒温电泳4.5 h左右，电泳参数设置为1.5 W/gel 1 h，8 W/gel 3.5 h。

1.2.4 凝胶染色及图像采集分析 凝胶染色采用改进的考马斯亮蓝染色法[21]。染色后的凝胶用ImageScanner Ⅲ扫描仪（GE Healthcare）进行扫描和图像采集。用ImageMaster 2D Platinum软件（GE Healthcare）进行蛋白点检测、凝胶匹配、将各个蛋白点的表达量归一化后进行比较分析，获得差异表达蛋白。

1.2.5 蛋白点胶内酶解 选取目标差异蛋白，进行胶内酶解，具体参考简化胶内酶解方法[22]。对挖取的蛋白点，酶解后收集上清液直接用于质谱鉴定。

1.2.6 酶解产物质谱鉴定及数据库搜索 酶解产物质谱鉴定采用Bruker公司的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS/MS Ⅱ，Bruker），主要操作参考Shen等[23]的方法进行。所得数据通过Mascot Distiller软件分析，分析结果（即肽指纹图谱PMF）利用Matrix science网站（http：//www.matrixscience.com）进行数据搜索和匹配。检索条件为：数据库（为NCBInr分类（Taxonomy）选择绿色植物界，酶类型选择胰蛋白酶，允许一个位点漏切， 固定修饰为Carbamidomethyl（C），可变修饰为Oxidation（M），肽段偏差为±300 ppm。软件设定检索得分阈值为72分，超过72分即认为匹配达到>95%的可信度（p<0.05）。

2 结果与分析

2.1 木薯块根韧皮部及木质部总蛋白的1-DE及2-DE

采用BPP法从每克木薯块根韧皮部和木质部鲜重材料中可以提取得到（0.522±0.132）mg和（0.408±0.045）mg总蛋白（图2-A），说明木薯块根中蛋白含量很低，且韧皮部蛋白含量略高于木质部。从1-DE结果（图2-B）可以看出，蛋白条带清晰，且分离性较好，没有出现拖尾现象，在高分子量区域（>100 ku）和低分子量区域（<20 ku）都可以检测到明显的蛋白条带。另外，从块根韧皮部和木质部的1-DE图谱中分别可以检测到（49±2）和（46±1）条蛋白带，而且2种组织的蛋白条带图谱很相似，个别条带在丰度上出现差异（图2-B 箭头所指）。

从2-DE图谱（图3-A、B）上看，不管是块根韧皮部还是木质部，其凝胶背景都很干净，蛋白点呈圆形或椭圆形，边界清晰，基本无拖尾现象。应用ImageMaster软件对这2种组织蛋白的2-DE图谱进行统计分析，结果从韧皮部中检测出（1 068±49）个蛋白点，从木质部中检测出（982±31）个蛋白点（图3-C），韧皮部分离的蛋白点数比木质部稍多，说明韧皮部中可能含有种类更为丰富的蛋白。对2-DE图谱中的蛋白点的分布区域进一步分析发现，2种组织的蛋白在不同pH值范围分布相对较为均匀，而在pH 5～6范围内稍多（图3-D）。2种组织的蛋白分子量主要集中在20～100 ku，低于20 ku和高于100 ku蛋白相对较少，在低于20 ku区域一些高丰度蛋白较多，尤其是在块根木质部中，高丰度蛋白分子量多集中在20 ku左右，而高于100 ku区域含有较多的低丰度蛋白（图3-E）。

2.2 块根韧皮部及木质部蛋白质组差异分析

为了研究木薯块根2个不同组织部位蛋白表达模式的差异，利用ImageMaster软件对同一发育时期块根韧皮部和木质部2-DE图谱进行比较分析，找到了265个差异表达的蛋白点（表达丰度变化1.5倍以上），包括46个组织特异性蛋白点及219个丰度差异蛋白点（图4-A、B），在韧皮部发现了29个特异蛋白点（图4-A），119个相对于木质部表达上调的蛋白点，在木质部发现17个特异蛋白点（图4-B），100个相对于韧皮部表达上调的蛋白点。这些差异蛋白点有可能与韧皮部和木质部的不同代谢调控生理活动相关。因此，鉴定出这些差异蛋白信息将对于理解木薯块根同化物转运和淀粉积累调控机制具有十分重要的参考价值。

2.3 差异蛋白点胶内酶解及MALDI-TOF-MS分析

在木薯块根韧皮部和木质部2-DE凝胶上各选取7个重复性好且分离性好的代表性差异蛋白点进行胶内酶解，随后进行质谱鉴定，获得PMF图谱（图5-A）。从所得的PMF图谱上看（图5-A），主要肽段峰集中在800～2 500（m/z）之间，这样的酶切片段更加有利于后续的数据库搜索以及进一步的二级质谱分析。肽段主峰的信噪比较高，角蛋白峰（1 475.754）较少且信号较低，说明肽段抽提产物中含杂质较少，无角蛋白污染。大多数蛋白的总肽段数在30～50左右，最高可达118条（表1），而且典型的胰蛋白酶自切峰（2 163.071）强度也较低，说明该方法中酶切效率也较高，自切程度低。由于热带作物木薯没有专用蛋白数据库，因此将质谱结果通过Mascot Distiller软件分析后，利用Matrix Science搜索引擎（http：//www.matrixscience.com/search）在NCBInr绿色植物总库中进行搜索，最终有8个蛋白点的一级质谱搜库得分值超过了72分可信值（p<0.05），鉴定成功率在60%左右。

2.4 鉴定蛋白的生物信息学分析

在鉴定出的8个蛋白点中，有2个为组织特异性蛋白（Spot C1，Spot C8），其余蛋白点为组织表达差异蛋白。对搜库得到的可信蛋白理论等电点和分子量与实验测得等电点和分子量进行比较，发现实验值和理论值基本一致，在雷达示意图中比值都集中在1附近（图5-B）。只有个别蛋白的等电点和分子量出现偏差，例如Spot C1，鉴定结果发现这些蛋白是某些蛋白的亚基，而执行生物学功能的蛋白通常是由多亚基组成，在进行变性胶电泳时可以将其各个亚基分离。因此，等电点和分子量会出现偏移现象。另外一些鉴定蛋白，如Spot C5，是葡萄物种的推测蛋白，将其氨基酸序列在NCBI数据库中进行Blast比对，与其同源性较高的大多数蛋白基本都是18 ku热激蛋白（18.2 ku class I heat shock protein）家族成员，从而确定该蛋白也属于这一家族。可以发现，木薯块根中尤其是木质部中18 ku热激蛋白表达量非常高（表1；图4），这可能与木薯的优良耐干旱特性密切相关。

同时，利用NCBI中的COG数据库对已鉴定蛋白进行功能分类分析，发现蛋白功能可归于5类：1）翻译后修饰、蛋白质周转或分子伴侣相关（O）， 有3个蛋白， 分别是C1，C5，C6； 2）无机离子转运和代谢（P），有2个蛋白，分别是C2，C4；3）转译，核糖体结构和生物起源，有1个蛋白；4）氨基酸转运和代谢，有1个蛋白；5）信号转导机制，有1个蛋白（表1；图5-C）。

3 讨论与结论

3.1 木薯块根韧皮部和木质部蛋白提取及双向电泳方法的确定

植物蛋白提取技术一直是蛋白质组学研究中的关键技术，蛋白提取质量的好坏会直接影响到后续实验的可靠性。不同的植物组织结构及成分不同，适用的蛋白提取方法也不尽相同。木薯块根尤其是木质部中含有大量的淀粉及可溶性糖，而韧皮部中含有大量纤维成分，传统的蛋白提取方法（如TCA/丙酮沉淀法[24-25]）通常难以高效去除这些物质获得高纯度蛋白，而且繁琐的提取过程会增加蛋白损失率。酚抽法[26-27]可以选择性将蛋白分离至酚相中，多糖、多酚及盐分可以保留在水相中，得到纯度较高的蛋白产物。采用BPP法优化改进了传统酚抽法，其蛋白提取液中含有强除杂能力的试剂硼砂（Borax）和聚乙稀聚吡咯烷酮（PVPP），较高浓度的β-巯基乙醇和维生素C可以降低蛋白酶活性从而避免蛋白降解。本研究采用BPP蛋白提取方法，制备出适合双向电泳的质量较高的蛋白样品。除了蛋白提取质量的好坏会影响2-DE结果外，水化上样、等电聚焦、胶条平衡、二向SDS-PAGE电泳及凝胶染色等技术环节也会对结果产生较大的影响。等电聚焦是否充分直接影响到蛋白一向分离效果，聚焦不足蛋白不能有效分离会导致横向拖尾，聚焦过度同样会出现横向拖尾现象且易丢失低丰度点。在进行木薯叶片蛋白质组学研究发现，蛋白上样量在1～1.5 mg范围时，10 000 V电压聚焦至130 000 Vh可以获得较好的聚焦效果，得到较多的蛋白点[28]。因而将该聚焦条件应用到木薯块根时，同样获得不错的分离效果。同时考虑后续质谱分析，采用具有高灵敏度和质谱兼容性的改进考马斯亮蓝染色法[21]，获得背景干净，蛋白点圆形或椭圆形的木薯块根2-DE图谱。

3.2 鉴定蛋白的功能分析

所鉴定蛋白涉及到蛋白翻译后修饰，无机离子和氨基酸转运代谢，分子伴侣以及信号转导等生物学功能，可能与同化物在韧皮部卸载转运，信号感受和远距离传递，糖代谢相关酶活性调控以及淀粉积累等生物学过程密切相关。

本研究发现已鉴定的8个蛋白中有2个是组织特异表达的，其中Spot C1鉴定为26S蛋白酶调节亚基，在韧皮部中特异表达，而Spot C8为蛋白激酶，在木质部中特异表达，前者与蛋白质周转相关，而后者与蛋白质磷酸化相关，功能分类上与信号转导相关。

抗坏血酸氧化酶（Spot C2）、MnSOD（Spot C4）和过氧化还原酶（Spot C6）都是生物体内重要的抗氧化酶。植物即使在最佳的生长条件下也能通过新陈代谢途径产生活性氧比如电子传递等途径，过多的活性氧会使植物产生氧化损伤，而抗坏血酸氧化酶、MnSOD和过氧化还原酶能够有效消除活性氧的产生，是阻止氧化胁迫的重要组分[29]。本研究中，抗坏血酸氧化酶、MnSOD和过氧化还原酶在木质部中大量上调表达，可能是木质部中淀粉形成和贮藏过程会消耗大量的能量，由于能量消耗和无机离子转运过程中产生许多活性氧，而抗坏血酸氧化酶、MnSOD和过氧化还原酶大量表达就是为了消除活性氧的产生，避免对木薯块根木质部在淀粉积累过程中产生氧化胁迫，而使细胞内氧化还原内环境受到破坏，从而影响细胞的正常代谢和植物正常的生长发育过程。因此，初步推断木薯块根淀粉积累的过程中能够促进抗氧化蛋白的表达。

翻译起始因子5A（Spot C3）是调控生物生长发育、衰老及环境适应等的重要因子，有研究表明它是调控细胞增殖生长和衰老的重要分子开关[30]。对正在衰老的番茄花、子叶、果实和成熟的凤梨果实的研究发现eIF5A的大量表达，证实eIF5A与植物细胞衰老关系密切[30，31]。本研究中，翻译起始因子5A在木薯块根木质部中大量上调表达，可能与本试验取材是成熟的木薯块根相关，淀粉在木薯块根木质部薄壁细胞中大量积累，但同时有许多细胞不断的衰老死亡，以此促进了翻译起始因子5A的表达。

谷氨酰胺合成酶（Spot C7）是一种控制氮代谢的酶，能够吸收无机氮转换为有机氮，能够催化铵离子和谷氨酸相结合产生谷氨酸盐，并伴随有能量的消耗，而给植物供给营养[32]。研究表明，木薯块根淀粉含量与谷氨酰胺合成酶是正相关[33]。本研究所鉴定的谷氨酰胺合成酶在木薯块根木质部的表达量高于韧皮部，结合已有的研究初步说明木薯块根木质部淀粉积累过程中，需要大量表达谷氨酰胺合成酶来调节体内的氮代谢，促进光合产物的运输和淀粉的有效合成及积累。

18 ku热激蛋白Ⅰ（Spot C5）在木质部中相对上调表达，已有研究发现其与植物的水分胁迫应答及耐旱特性相关[34]。该蛋白主要作为分子伴侣执行功能，除了与植物水分胁迫应答相关外，小分子热激蛋白还可以提高植物的耐寒性[35]，为提高木薯的抗寒能力提供了一个新思路。

木薯块根主要是由于少数（约3～10条）纤维状须根的次级生长活动造成[36]，形成层活动分化出大量次生薄壁细胞，使得根部迅速膨大[37]，与此同时光合作用产生的大量糖类运输至薄壁细胞中，以淀粉形式积累贮藏。在此过程中，木薯块根的韧皮部和木质部的蛋白表达发生了相应变化，从而调节淀粉积累过程的有效进行。虽本研究结果为研究木薯块根淀粉积累调控提供了一定的线索，但仍有许多差异蛋白未鉴定，这些蛋白中可能也存在着许多有价值的关键蛋白，需要在今后的研究中进一步做功能鉴定分析。

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