痛风康对急性痛风性关节炎大鼠的治疗作用及机制研究

尤元梅，袁松2，徐凌

(1. 皖北卫生职业学院，安徽 宿州 234000；2. 安徽省宿州市中医院，安徽 宿州 234000)

痛风性关节炎归属于中医“痹证”、“痛风”范畴。“痛风”之名最早见于梁代陶弘景的《名医别录》“……百节痛风无久新者”。《丹溪心法.痛风》描述痛风的症状为“四肢百骸走痛是也”，还指出“他方谓白虎历节证”。《证治准绳.痛风》认为痛风是由“风湿客于肾经，血脉瘀滞所致”。典型的急性痛风性关节炎的特点是起病急骤，有时甚至呈暴发性，通常第一次突然发作多在夜间，受累关节及其周围软组织明显红肿、发热、压痛及活动受限，局部接触被单等物时疼痛加重，可持续3～10 d。急性痛风性关节炎发作期绝大多数患者血清尿酸升高，肿胀关节腔内可有积液，抽取关节炎检查，约95%以上急性痛风性关节炎滑液中可发现尿酸盐结晶。急性痛风性关节炎临床治疗首要应尽早控制临床症状，西药治疗以抗炎止痛药秋水仙碱及非甾体抗炎药COX-2抑制剂(如塞来昔布)或COX-1抑制剂(如双氯芬酸等)。但研究表明秋水仙碱胃肠道反应明显有导致胃肠道出血的可能，非甾体类抗炎药(NSAIDs)有心血管毒性的可能，本研究以中医理论为指导，结合现代医学实验方法，复制急性痛风性关节炎大鼠模型，评价大鼠关节症状改善情况，研究中药组方痛风康对急性痛风性关节炎治疗效果，在前期研究基础上探讨痛风康治疗急性痛风性关节炎的可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康SD大鼠60只，雄性，体重(200±20) g，由皖南实验中心提供，合格证号：SCXK(皖)2011-002。

1.2主要药物与试剂 痛风康方药组成：附子6 g、续断10 g、白术10 g、白芥子10 g、制南星10 g、桃仁10 g、泽兰20 g、僵蚕10 g、苦参6 g、土茯苓60 g、泽泻20 g，上述药材由宿州市中医医院提供。吲哚美辛片： 25毫克/片(上海辛帕斯制药有限公司，国药准字H14020549)。试剂：吐温80( Sigma 公司，59924)、微晶型尿酸钠(Sigma 公司，SU287501)、大鼠细胞间黏附因子-1(ICAM-1)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β) ELISA 试剂盒(上海信裕生物科技有限公司)。

1.3主要仪器设备 足趾容积测量仪、电热恒温箱、酶标仪、显微镜、恒温箱、干燥箱、冰箱、微孔板迷你离心机、搅拌器等。

1.4实验方法

1.4.1动物饲养条件 动物饲养于安静、整洁环境下，分笼饲养，室温控制在25 ℃，相对湿度55%～65%，塑料笼内以消毒木屑作垫料，正常饮食，自由饮水。

1.4.2动物分组 电脑随机数字法分为6组：正常组(Normal)、模型组(Model)、吲哚美辛组(Indometacin)、痛风康高剂量组(H-TFG)、痛风康中剂量组(M-TFG)、痛风康低剂量组(L-TFG)。每组10只，总计60只大鼠。

1.4.3动物给药 适应性喂养14 d后开始给药。依据成人标准体重70 kg计算，用体表面积法得出大鼠每日灌胃剂量是成人的6.25倍。中药组方痛风康成人每日剂量为120 g，折算出大鼠每日药物剂量为10.71 g/kg。设定大鼠高、中、低剂量组用药剂量分别为21.42 g/kg、10.71 g/kg、5.36 g/kg。吲哚美辛用药剂量为成人每日75 mg，折算出大鼠每日给药剂量为6.70 mg/kg。Normal组：相同体积生理盐水灌胃，每天1次，共8 d；Model组：相同体积生理盐水灌胃，每天1次，共8 d；Indometacin组：吲哚美辛混悬液(6.70 mg/kg)灌胃，每天1次，共8 d；H-TFG组：痛风康高浓度溶液(21.42 g/kg)灌胃，每天1次，共8 d；M-TFG组：痛风康中浓度溶液(10.71 g/kg)灌胃，每天1次，共8 d；L-TFG组：痛风康低浓度溶液(5.36 g/kg)灌胃，每天1次，共8 d。灌胃8 d后，于实验第5天灌胃前，除Normal组外其余5组均造模，第8天灌胃后2 h取材并处死大鼠。

1.4.4动物造模 参照文献中Coderre方法[1]制备尿酸钠溶液并进行造模。吐温80 1 ml，尿酸钠结晶250 mg，生理盐水9 ml，混合加热搅拌配制成尿酸钠溶液10 ml。除正常组外，其余组选择大鼠右踝关节腔，用4号注射器注射0.2 ml尿酸钠溶液，复制急性痛风性关节炎大鼠模型。

1.5动物关节症状评价

1.5.1关节肿胀指数的测定 测定时间造模前、造模后4 h、24 h、48 h、72 h。测量方法：试验前每鼠右后足踝关节处用记号笔作一清晰横线，分别于造模后4 h、24 h、48 h和72 h用足趾容积测量仪测取每鼠右后足足趾容积[2]，以造模后各时间点足容积-造模前足容积的差值作为关节肿胀度。

1.5.2步态观察评分[3]造模后4 h、24 h、48 h、72 h分别观察大鼠步态：0级为正常步态，评分为1分；1级为足着地减轻，轻度跛行，评分为2分；2级为明显跛行评分为3分；3级为足完全离地，三足步态评分为4分。

1.5.3大鼠造模后体质量测定 造模后4 h、24 h、48 h、72 h分别测定大鼠体质量。

1.6检测指标及方法

1.6.1观察样品的采集与处理 大鼠末次灌胃72 h后，用10%水合氯醛0.3 ml/100 g剂量腹腔注射麻醉后，经腹主动脉采血，每只大鼠取5 ml血置于玻璃离心管，2500 r/min离心5 min，收集上层血清约1 ml。

1.6.2观察指标及方法 血清中ICAM-1、TNF-α、IL-1β采用酶联免疫吸附分析(ELISA)，严格按照说明书进行含量检测[4]。

2 结果

2.1痛风康对痛风性关节炎大鼠体质量的影响 各组在造模前24 h，造膜后24 h、48 h及72 h的体质量差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量比较单位：g

2.2痛风康对痛风性关节炎大鼠踝关节肿胀度的影响 大鼠右踝关节一次性注射尿酸钠溶液后，大鼠内踝的胫跗关节均出现不同程度的关节肿胀、行走迟缓、足爪卷曲，肢体不愿着力负重，个别动物后肢过度俯屈甚至跛行，局部解剖发现尿酸盐结晶沉着于踝关节腔内，光镜下可见明显的关节炎病理改变，示造模成功。除正常组外，大鼠踝关节肿胀度在造模后4 h开始上升，Model组与Normal组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。Indometacin组、H-TFG组、M-TFG组同Model组比较，在用药24～72 h，大鼠踝关节肿胀度明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠造模后关节肿胀度比较单位：ml

2.3痛风康对大鼠步态的影响 与Normal组比较，4～24 h Model组大鼠步态评分明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，说明造模成功。与Model组比较，Indometacin组、H-TFG组、M-TFG组、L-TFG组在用药24～72 h大鼠步态评分明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠步态评分比较单位：分

2.4痛风康对大鼠炎症因子TNF-α、IL-β、ICAM-1的影响 与Normal组比较，Model组大鼠血清的TNF-α、IL-β、ICAM-1水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与Normal组比较，Indometacin组、H-TFG组、M-TFG组、L-TFG组的TNF-α、IL-β、ICAM-1水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠血清中TNF-α、IL-β、ICAM-1水平比较

3 讨论

急性痛风性关节炎是由于单钠尿酸盐(MSU)晶体沉积导致的急性关节及周围组织炎症[5]。TLR/NF-κB通路是参与调节机体炎症、坏死及凋亡等的重要信号通路，同时参与调节体内重要细胞因子、炎症因子、黏附分子等的表达[6]。本实验前期在从“TLR/NF-κB”信号通路中下游的关键信号分子及信号通路的部分效应产物着手，通过痛风康对急性痛风性关节炎大鼠关节滑膜组织TLR4mRNA、MyD88mRNA、TRAF6mRNA、NF-κBp65指标的观察及痛风康对大鼠关节滑膜组织病理变化的影响，探究痛风康治疗急性痛风性关节炎的具体作用机制，实验结果显示痛风康可改善尿酸钠结晶致急性痛风性关节炎模型大鼠的滑膜组织病理变化。下调急性痛风性关节炎模型大鼠关节滑膜组织中TLR4mRNA、MyD88mRNA、TRAF-6mRNA、NF-κBp65的表达，对TLR4/NF-κB通路的干预，可能是痛风康治疗急性痛风性关节炎的作用机制之一。本次实验在前期研究的基础上通过对大鼠体质量、大鼠踝关节肿胀度、大鼠步态评分及大鼠血清中ICAM-1、TNF-a、IL-1β指标的分析，进一步探究痛风康治疗急性痛风性关节炎的作用机制。ICAM-1可介导细胞与细胞外基质间，以及细胞与细胞间相互粘连的一种跨膜糖蛋白，可促进白细胞聚集、黏附和浸润，促进淋巴细胞活化，介导免疫炎症反应，ICAM-1的持续表达可引起关节、组织器官的损伤[7-8]。TNF-a在关节炎众多炎性细胞因子中表现最为活跃，可激活内皮细胞、促进白细胞聚集、活化破骨细胞，导致炎症发生及滑膜与骨的破坏[9]，并可诱导IL-1β、IL-6等细胞因子的产生，作用于血管内皮细胞，导致细胞出血、坏死[10]。IL-1β是IL-1家族中有促炎作用的成员之一，可抑制骨和软骨的修复，IL-1β是痛风急性发作的关键细胞因子[11]，可促进中性粒细胞、吞噬细胞在炎症部位募集，引起红、肿、热、痛等关节炎表现，同时释放的炎性物质可刺激吞噬细胞产生更多 IL-1β，使炎症反应加剧[3]。本研究发现，Model组大鼠血清中ICAM-1、TNF-a、IL-1β显著升高，H-TFG组能显著降低血清中ICAM-1、TNF-a、IL-1β的水平。表明痛风康能够抑制TLR4/NF-κB通路下游的炎症因子。痛风康对大鼠踝关节肿胀度、步态评分有抑制作用，同时对大鼠体质量并未有明显影响。今后，仍需继续深入研究痛风康治疗痛风性关节炎的作用机制，以期为临床治疗痛风性关节炎提供实验依据。