13 种小白菜苗期耐盐比较分析及耐性指标筛选*

余如刚，张 迪，余心悦，唐 钢，杨娇娇，赵有弟，吴 婵

（淮北师范大学 生命科学学院，安徽 淮北 235000）

土壤盐渍化是被广泛关注的全球性问题[1]。土壤中过高的盐离子，如钠离子（Na+）和氯离子（Cl-），易引发离子毒害，抑制作物生长和发育，降低作物产量和品质[1-2]。据联合国粮食及农业组织统计，全球有各种盐渍土约8 亿hm2[3]。中国盐渍土面积约为0.36 亿hm2，随着化肥过量使用和管理措施落后等原因，盐渍土面积呈逐年增加的趋势[4]。随着人口压力不断增大，开发利用盐渍化土壤成为缓解土地危机的有效措施[5-7]。因此，筛选和培育优异耐盐作物种质资源对盐渍土壤利用和保障粮食安全具有重要意义[6,8]。

小白菜（Brassica rapaL.ssp.chinensis）隶属十字花科芸薹属，是中国重要的叶菜类蔬菜作物。其具有叶表面积大、含水量高、组织脆嫩、易黄化和腐烂等特点，不易长距离运输，宜在消费地周边种植[9]。因此，研究小白菜在盐胁迫下的生长规律，筛选与培育耐盐小白菜种质资源，明确其耐盐机制，不仅能有效利用盐渍化土地，而且有利于周边地区市场供应。MEMON 等[10]发现：50 mmol/L NaCl 条件下，小白菜种子萌发和幼苗生长良好，超过该浓度则生长受到抑制。作物对盐的耐受性是一个复杂的综合性状，因此，近年来耐盐种质资源筛选的方法多以主成分分析法、隶属函数法、回归分析和聚类分析法等多指标综合评价方法为主[11-15]。本研究以13 份不同小白菜种质的苗期为研究对象，以形态和生理生化指标的耐盐系数为基础，采用主成分分析、隶属函数值法、聚类分析和逐步回归分析等多元分析方法，综合评价不同品种小白菜的耐盐性，筛选耐盐鉴定指标，建立苗期耐盐性筛选评价体系，为小白菜耐盐性种质资源的挖掘和快速、准确地评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

13 份供试小白菜品种为淮北师范大学生命科学学院园艺系收集的商用品种（表1）。

表1 供试小白菜品种及来源Tab.1 The origins of Brassica rapa L.ssp.chinensis varieties in test

1.2 试验方法

1.2.1 材料培养与处理

试验于2019 年9—11 月在淮北师范大学园艺实训基地进行。采用盆栽（口径13 cm，高12 cm）试验，以洗净的河沙为基质，挑选均匀一致的小白菜种子直接播种。出现真叶时，间隔1 d 浇100 mL 霍格兰营养液；幼苗长到2～3 片真叶时疏苗，每盆留长势一致的幼苗6 株。播种14 d 后设置第1 次盐胁迫，共3 个处理：无NaCl 的霍格兰营养液（对照）以及添加NaCl 后浓度分别为100 和200 mmol/L[10]的霍格兰营养液处理，每盆各添加100 mL 处理液；之后，每间隔1 d 浇100 mL无NaCl 的霍格兰营养液。播种21 d 后，进行第2 次盐胁迫（同第1 次盐胁迫处理），每间隔1 d添加含不同浓度NaCl（0、100 和200 mmol/L）的霍格兰营养液100 mL。试验期间每盆添加营养液均为上午和下午各50 mL。播种28 d 后统计成活率，并分别取根和叶样品进行形态和生理指标测定。每品种各处理设3 个生物学重复。

根据观察不同浓度NaCl 处理下小白菜形态特征，发现四季高脚甜白菜、四季小白菜和矮萁苏州青在200 mmol/L NaCl 处理14 d 后植株几乎全部死亡。因此，本研究仅以100 mmol/L NaCl 处理下16 个单项指标的耐盐系数为评价依据，利用多元分析法对13 份小白菜种质的耐盐性进行评价。

1.2.2 形态指标测定

播种28 d 后从每盆随机选取3 株长势一致的幼苗，用直尺测量基质表面到植株最顶部的距离作为株高（PH）；选取植株的第3 片真叶，用直尺测量叶宽（LW）；取样时将根、叶分开，分别称量根鲜质量（RFW）和叶鲜质量（LFW）；然后放于105 ℃烘箱中杀青1 h，再在70 ℃条件下烘干至恒质量，分别称量根干质量（RDW）和叶干质量（LDW）。

1.2.3 生理指标的测定

以叶片为研究对象，分别测定0（对照）和100 mmol/L NaCl 处理下各项生理指标。Na+和K+含量的测定在山东省农科院可持续发展研究所利用火焰光度计（FP-640，中国上海）进行；叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）、总叶绿素（TChl）、丙二醛（MDA）和可溶性蛋白（SP）含量的测定参照张志良等[16]的方法；过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性的测定采用紫外分光光度法，具体操作按照试剂盒说明书（POD-2-Y 和CAT-2-Y，科铭生物，苏州）进行；植株电导率（EC）的测定利用DDSJ-308F 电导率仪（上海雷磁有限公司）[17]进行。

1.2.4 数据处理与综合评价

采用Microsoft Excel 2010 处理原始数据；采用IBM SPSS 25.0 软件进行多元分析。具体指标计算如下[11,17]。

（1）计算各单项指标的耐盐系数（salinity tolerance coefficient，STC）

为了分析各单项指标之间的关系，将各指标的耐盐系数进行相关性分析。

（2）计算各小白菜品种综合指标（comprehensive index，CI）的隶属函数值[U（Xi）]

式中：Xi表示主成分分析所得的第i个综合指标值；Xmax和Xmin分别为各种质在第i个综合指标值中的最大值和最小值。

在第i个综合指标中，当某种质的隶属函数值U（Xi）最大为1.00 时，表示该种质在第i个综合指标上评价为耐盐性最强；而当U（Xi）最小为0.00 时，表示该种质在第i个综合指标上评价为耐盐性最弱。利用SPSS 25.0 软件对6 个形态指标和10 个生理生化指标的耐盐系数进行主成分分析，计算各主成分的特征向量和贡献率，并根据各特征向量的绝对值将不同指标划分到不同的主成分中。同一指标在各因子中的最大绝对值所在位置即为其所属主成分。

（3）计算各小白菜品种综合指标的权重（Wi）

式中：Wi表示第i个综合指标在所有综合指标中的重要程度；Pi为主成分分析第i个综合指标对全部综合指标的贡献率。

（4）计算各小白菜品种的耐盐性综合评价值（D）

为了相对客观和科学合理地评价各小白菜品种的耐盐性，利用最小距离准则对D值进行系统聚类分析。同时，为了分析各单项指标与耐盐性之间的关系，筛选准确的耐盐鉴定指标，探讨可用于预测小白菜耐盐性评价的数学模型，将各指标的耐盐系数（STC 值）作为自变量，回归预测综合评价值（D′）作为因变量进行逐步回归分析，建立最佳回归方程。

2 结果与分析

2.1 不同小白菜品种各指标的耐盐系数及其相关关系分析

由表2 可知：各单项指标的耐盐系数在13份小白菜品种间变化显著。变异范围为5.43%～69.27%；其中，Na+含量的变异系数最大，变异系数较大的为K+、SP、RDW、LFW、CAT、LDW、RFW、Chlb、POD 和TChl 指标，说明盐胁迫对这些指标的影响较大。不同小白菜品种经盐处理后，LW、RFW、LFW、RDW 和LDW 指标值与对照相比有所下降（STC＜1），Na+含量指标值与对照相比有所上升（STC＞1），其他指标值与对照相比则在不同品种中呈不同的变化（STC＜1或STC＜1）。说明单项指标的耐盐系数只能反映小白菜耐盐性的局部数据，难以直接决定各品种的耐盐性。

由表3 可知：PH 与Chla、Chlb、TChl、SP、EC 显著相关；LW 与K+、LFW 与K+、SP 与POD、EC 与CAT 均显著相关；RFW 与RDW、MDA与K+、POD 与Na+极显著相关。说明各指标提供的评价信息存在重叠，即小白菜耐盐性是一种综合性状的表现；同时，各指标在小白菜耐盐性评价中发挥的作用也不尽相同。因此，需要进一步鉴定才能够评价盐胁迫下小白菜品种的耐盐指标。

表3 各单项指标耐盐系数的相关系数矩阵Tab.3 Correlation coefficient matrix of salinity tolerance coefficient of every single index

2.2 不同小白菜品种耐盐性评价指标的主成分分析

主成分分析结果（表4）显示：前6 个综合评价指标（CI）的贡献率分别为28.13%、19.40%、16.18%、12.82%、7.32% 和4.41%，累计贡献率为88.25%，因此，可将16 个初始测定指标转换为6 个综合指标，分别定义为第1（CI1）～第6（CI6）主成分，能代表16 个单项指标携带的绝大部分信息，可以用这6 个主成分指标对13 份小白菜品种的耐盐性进行概括。分析显示：CI1中主要与TChl、Chla 和Chlb 指标相关；CI2中主要与Na+、PH、EC、RDW 和SP 指标相关；CI3中主要与RFW 指标相关；CI4中主要与LFW、POD 和LDW 指标相关；CI5中主要与LW 和Na+指标相关；CI6中主要与CAT 和MDA指标相关。

表4 主成分分析各综合指标系数及贡献率Tab.4 Coefficients and contribution ratio of comprehensive indicators of principal component

2.3 不同品种小白菜苗期耐盐性综合评价

依据综合指标值，通过公式（2）得出13 份小白菜种质的隶属函数值；通过公式（3）计算各综合指标在主成分贡献率中的权重，得出6 个综合指标的权重分别为0.31、0.22、0.18、0.14、0.08和0.05；利用公式（4）计算13 份小白菜的综合耐盐评价值（D）（表5）。依据D值对13 份小白菜种质的耐盐性强弱进行排序，D值最高的为特种上海青（0.77），表明其耐盐性最强；D值最低的为绿领火白菜和耐热四季甜白菜（均为0.27），表明其耐盐性最弱。对D值进行系统聚类分析，可将13 份小白菜种质划分为4 类（图1）：特种上海青为第Ⅰ类，为高度耐盐型；上海四月慢、绿领矮脚黄、矮萁苏州青、黄金小白菜、四季小白菜、四季高脚甜白菜和黑美人为第Ⅱ类，为耐盐型；兔子腿矮脚黄、四倍体矮脚黄和白叶四月慢为第Ⅲ类，为中度耐盐型；耐热四季甜白菜和绿领火白菜为第Ⅳ类，为盐敏感型。

图1 13 份小白菜品种耐盐性聚类分析Fig.1 Classified cluster diagram on salt tolerance of thirteen Brassica rapa L.ssp. chinensis varieties

表5 13 份小白菜品种综合指标隶属函数分析Tab.5 Subordinate function analysis of comprehensive index in thirteen B.rapa L.ssp.chinensis varieties

2.4 回归分析及小白菜耐盐鉴定指标的选择

以D值为因变量，16 个指标的耐盐系数为自变量进行逐步线性回归分析，建立回归方程：D′=-0.206+0.632 PH+0.275 RDW（P＜0.05，R2=0.589），利用该回归方程对13 份种质进行回归预测综合评价，平均估算精度为85.06%，表明盐处理条件下，耐盐性较高的品种其根干质量（RDW）和株高（PH）增加趋势明显。因此，根干质量和株高可用于预测相同条件下不同小白菜品种的耐盐性。

3 讨论

区域性土壤盐渍化已成为蔬菜生产中最难控制的环境污染之一。研究显示：盐胁迫影响小白菜的生长和产量，且不同小白菜种质间的耐盐性存在显著差异[10,18-19]。因此，如何通过高效的方法筛选和鉴定小白菜耐盐种质显得尤为重要。幼苗期和萌发期是作物耐盐性筛选的主要生育阶段[20]，并且幼苗期的耐盐性与成株的耐盐性存在相关性[21]。盐胁迫对幼苗期的影响主要表现在形态、生理、生化和产量等指标上[22]，且各指标在耐盐性评价中所起作用不同[11-12,15,17]，因此，在作物耐盐性评价过程中应结合多种指标综合评价，包括耐盐评价指标体系和综合评价数学模型的选择[23]。对于小白菜耐盐性的评价已有少量报道，徐芬芬等[18]以30 份小白菜萌发期的相对发芽率、相对胚芽长、相对胚鲜质量、相对胚根长和相对根毛区宽度等5 个指标为基础，利用隶属函数值累加求平均值法进行耐盐性评价。尽管该方法是利用隶属函数法对小白菜多个性状指标进行综合评价，但是评价结果不能判断各指标对耐盐性评价所起的作用大小。

利用主成分分析、隶属函数法和逐步回归分析法等多元分析法，不仅可以结合多个指标对作物的耐盐性进行综合评价，而且还能建立可靠的评价体系。该方法已用于绿豆[11]、南瓜[12]和大豆[15]等作物的耐盐性评价及预测模型建立。于崧等[11]测定盐胁迫下绿豆苗期的20 个形态和生理指标，通过多元分析方法评价30 个绿豆品种的耐盐碱性，并建立评价模型，筛选出7 个耐盐碱鉴定单项指标。可见，多元分析法是评价作物耐盐性和建立耐盐性评价体系的有效方法之一，但利用多元分析法对小白菜种质耐盐性筛选的研究鲜有报道。本研究选择6 个形态指标和10 个生理生化指标进行测定，并运用多元分析方法对13 份小白菜苗期耐盐性进行综合评价，这是本研究的创新点。

耐盐系数通常被用作评价耐盐性的标准[11-13,15,18]。本研究以16 个单项指标的耐盐系数为基础，利用主成分分析将16 个指标转换为6 个综合指标，并得到不同品种小白菜幼苗的耐盐性综合评价值（D），依据D值聚类分析结果，较为客观地将13 份小白菜种质分为高度耐盐、耐盐、中度耐盐和盐敏感4 种类型。其中，四倍体矮脚黄（中度耐盐）评价结果与徐芬芬等[18]的研究结果稍有差异，其评价为高度耐盐，这可能是由于评价方法的差异造成，具体需要进一步验证。此外，本研究通过逐步回归法建立了小白菜苗期耐盐性预测模型，该模型平均估算精度为85.06%，可用于在幼苗阶段筛选小白菜耐盐种质。

4 结论

本研究将供试的13 份小白菜种质分为高度耐盐（1 个）、耐盐（7 个）、中度耐盐（3 个）和盐敏感（2 个）4 个类型，其中特种上海青为高度耐盐型小白菜，耐热四季甜白菜和绿领火白菜为盐敏感型小白菜。研究建立了小白菜幼苗耐盐性预测模型D′=-0.206+0.632PH+0.275RDW，筛选出根干质量（RDW）和株高（PH）为小白菜耐盐性鉴定指标。研究结果将为小白菜耐盐种质资源筛选及良种选育提供科学支持。