水杨酸诱导三七抗三七圆斑病的机理研究*

杨 宽，王慧玲，戴 蕾，李佳洲，罗 成，郭力维，杜云龙，何霞红

（1.云南农业大学，云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650201；2.西南林业大学，云南 昆明 650244）

三七圆斑病由子囊菌门（Ascomycota）暗色菌科（Dematiaceae）菌刺孢属（Mycocentrospora）槭菌刺孢[Mycocentrospora acerina（Hartig）Deighton]引起，该病于1993 年在云南文山首次被发现[1]，是危害三七地上部的主要病害，若防治不及时，极端年份发病率可达80.00%，甚至毁园，严重影响三七产业的发展[2-3]。槭菌刺孢主要分布于欧洲和北美洲，寄主范围广，可寄生于槭树科、十字花科和茄科等16 科植物。在中国可引起细辛叶枯病和三七圆斑病，均属于毁灭性病害[4-6]。三七圆斑病主要集中在雨季发生，由于其喜低温高湿且传染性强，雨季来临时，常造成大规模的流行和传播[7-8]，目前生产上仍以化学防治为主，常用的药剂主要有戊唑醇、代森锰锌和多抗霉素等[9-10]。然而，使用化学杀菌剂存在农药残留、病原菌产生抗药性以及环境污染等问题，因此，寻求一种绿色防控措施将是控制三七圆斑病的必要途径。

植物的诱导抗病性是植物在外界物理因子（高温和紫外线等）、化学因子（水杨酸和茉莉酮酸等）和生物因子（真菌、细菌和病毒等）刺激下产生抗病性的现象[11-13]，且不影响其自身遗传，因此可通过外源因子诱导植物自身免疫力，从而减少化学农药的使用[11]，是一种绿色高效的植物病虫害防治方法[12-17]。水杨酸（salicylic acid，SA）是植物抗病反应的重要信号分子之一，植物体内SA 的积累被认为是抗病性提高的标志。SA 不仅参与植物的过敏反应和系统获得抗性反应，也是病原物侵染植物后引起防卫反应提高信号传递过程中的重要组成成分[18]。SA 主要通过诱导植物防御相关酶活性、诱导病程相关蛋白合成以及抑制病原致病性酶活性等方式来提高植物抗病防御反应[19-21]。高倩倩[22]研究表明：外源添加SA 可以通过提高植物体内抗氧化酶活性、增强渗透调节能力和提高细胞活性氧清除能力来有效提高不结球白菜对根肿病的抗性。NURAMALEE 等[23]研究表明：SA 诱导后，橡胶树的棕榈疫霉病发病严重程度显著降低41%，过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性显著提高，HbCAT1、HbPAL和HbPR1j基因表达上调，提高了橡胶树的抗病性。

SA 诱导植物抗病性已有很多研究，但SA 在三七生长中的作用和诱导抗病性鲜有报道。本研究以三七为试验材料，以三七圆斑病为研究对象，开展SA 调控三七与槭菌刺孢相互作用的机制研究，明确SA 诱导三七抗圆斑病的机理，为防治三七圆斑病提供新途径和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植株

健康的一年生三七植株均采自云南农业大学现代农业教育科研基地；槭菌刺孢由云南农业大学植物病理重点实验室提供。

1.1.2 供试试剂

水杨酸（SA）和二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma 公司；美国Omega 公司生产的真菌总DNA 提取试剂盒；苏州科铭生物技术有限公司生产的过氧化氢试剂盒（微量法）、过氧化物酶试剂盒（微量法）、超氧化物岐化酶试剂盒（微量法）、苯丙氨酸解氨酶试剂盒（微量法）、丙二醛试剂盒（微量法）和脯氨酸试剂盒（微量法）。

1.2 方法

1.2.1 SA 对槭菌刺孢侵染三七叶片的影响

分别用浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 和6.0 mmol/L 的SA 溶液喷洒健康三七植株，以叶片上液滴不滴落为宜，3 d 后喷洒槭菌刺孢孢子悬浮液于叶片上，套袋保湿；以含有等体积的DMSO 无菌水喷洒三七后接种孢子悬浮液为对照。分别于处理6 和18 h 后剪取大小为0.5 cm×0.5 cm 的叶片置于血清瓶中，加入乙醇乳酚脱色液3 mL，用注射器抽真空直至叶片完全没入脱色液中，于室温静止72 h，直至叶绿素全部脱除。取出叶片，用50%乙醇漂洗2～3 次，用无菌水冲洗2～3 次，将冲洗干净的叶片置于棉兰染液中染色10 min，取出，用无菌水冲洗1 次，置于载玻片上，滴加50%甘油后盖上盖玻片保存，在徕卡显微镜下用可见光观察，拍照，统计并计算分生孢子的萌发率、芽管分枝率及附着胞产生率。

1.2.2 SA 对三七抗圆斑病的诱导效果测定

配制0.1、0.5、1.0、2.0 和4.0 mmol/L 的SA溶液，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤备用。选择12 盆长势一致的一年生健康三七苗，每个处理2 盆，分别用上述配制好的SA 溶液喷洒三七苗，以喷洒含等体积DMSO 的无菌水为对照。5 d 后用接种针挑取在PDA 培养基上培养7 d 的圆斑病菌，并接种于三七叶片中间靠近叶脉处，每棵苗接种2 片叶片，套袋保湿，每天喷无菌水保湿，出现明显病斑后测量病斑直径，观察发病情况。

1.2.3 SA 诱导三七抗圆斑病的生理生化机制

选择40 盆长势一致、生长1 年的健康三七苗，每盆种植7 株三七苗，随机分成4 组，每组10 盆（即为1 个处理），设置以下4 个处理：①喷洒最佳浓度的SA 溶液；② 喷洒含DMSO 的无菌水；③只接种槭菌刺孢，每棵苗接种2 个叶片；④ 喷洒最佳浓度的SA 溶液5 d 后再接种槭菌刺孢，每棵苗接种2 个叶片；③和④接菌后套袋，每天喷洒无菌水保湿。分别于处理后1～7 d 剪取同一叶位的三七叶片，液氮速冻后于-80 ℃冰箱保存备用。

参照SIMA 等[24]的方法测定过氧化氢酶（CAT）活性；参照MARKKOLA 等[25]的方法测定过氧化物酶（POD）活性；超氧化物岐化酶（SOD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性以及丙二醛（MDA）含量的测定均参照邹芳斌等[26]的方法；脯氨酸（Pro）含量的测定参照曹广黎[27]的方法。

1.2.4 SA 诱导三七抗圆斑病的基因表达

选择20 盆长势一致、生长1 年的健康三七苗，每盆种植7 株三七苗，随机分成2 组，每组10 盆（即为1 个处理），设置以下2 个处理：①喷洒最佳浓度的SA 溶液，5 d 后接种槭菌刺孢，每棵苗接种2 个叶片；② 喷洒含DMSO 的无菌水，5 d 后接种槭菌刺孢，每棵苗接种2 个叶片。在喷洒SA 溶液和无菌水后的第3 和5 天分别进行第1、2 次叶片采样，在第2 次采样结束后立即接种槭菌刺孢并套袋，每天喷洒无菌水保湿，在接种后2 d进行第3 次采样。3 次采样均在同一时间进行，采集的三七叶片用液氮速冻，-80 ℃保存备用。

（1）三七叶片RNA 的提取

三七叶片RNA 的提取采用普洛麦格（北京）生物技术有限公司生产的EastepTM总RNA提取试剂盒。

（2）实时荧光定量PCR 测定基因的表达水平

①cDNA 合成：利用Fermentas 公司生产的RevertAidTMFirst-Strand cDNA synthesis kit 试剂盒将RNA 反转录合成cDNA 第1 链，试验方法参照试剂盒说明书进行。

② 实时荧光定量PCR 引物设计：利用Primer Express 软件（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）设计三七抗病基因PnPR10-1实时荧光定量PCR 引物。PCR 产物长度 200～250 bp，G+C 含量为 40%～60%，3′端不能连续有3 个G 或C，产物不能形成二级结构，正反向引物间均不能有连续的4 个互补碱基，引物长度一般为17～25 bp，退火温度约60 ℃。抗病基因PnPR10-1引物序列为：PnPR10-1-F：5′-ATGGGTGTCCAAAAGACCGAAG-3′，PnPR10-1-R：5′-CCAAGAGTGACGAGCTTGACGG-3′；内参基因Actin的引物序列为：Actin-F：5′-AGAGATTCCGTTGCCCAGAA-3′，Actin-R：5′-CAATTGATGGGCCAGACTCG-3′。引物合成委托北京擎科生物科技有限公司完成。

③实时荧光定量PCR 检测：利用Light Cycler®96 实时荧光定量PCR 仪进行。具体方法参照Roche 公司生产的FastStart Essential DNA Green Master 试剂盒说明书进行，实时荧光定量PCR 反应体系为20 µL：模板cDNA 5 µL，前后引物各1 µL，Master Mix 10 µL，PCR 级纯水3 µL。采用相对定量常用方法处理数据，即2t-ΔΔC法。RT-PCR 流程如下：95℃预变性6 min；95℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，循环45 次；溶解曲线反应条件为：95 ℃ 10 s，65 ℃1 min，97 ℃维持。

2 结果与分析

2.1 SA 处理对槭菌刺孢侵染的影响

由图1、2 可知：在SA 处理过的三七叶片上喷洒分生孢子，6 h 后对照叶片表面的分生孢子开始萌发，孢子萌发率为55.11%；用0.1、0.5、1.0 和2.0 mmol/L SA 处理的三七叶片表面分生孢子萌发率分别为26.45%、11.32%、8.90%和3.10%；而用4.0 和6.0 mmol/L SA 处理的三七叶片表面的分生孢子萌发率均为0，说明不同浓度的SA 处理三七叶片表面后，叶片表面的孢子萌发率会下降，且呈浓度效应。18 h 后对照叶片和处理叶片表面分生孢子产生的芽管与6 h 产生的芽管相比明显伸长，芽管数量增多，且部分芽管顶端产生了附着胞，对照叶片表面分生孢子萌发率为86.24%，芽管分枝率为83.33%，附着胞产生率为78.15%；用0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 和6.0 mmol/L SA 处理的三七叶片表面分生孢子萌发率、芽管分枝率和附着胞产生率均随着SA 浓度的增加而降低。

图1 水杨酸(SA)处理三七植株后槭菌刺孢的分生孢子在三七叶片表面的萌发情况Fig.1 Germination of Mycocentrospora acerina on the leave surface of Panax notoginseng after sprayed by different concentrations of salicylic acid（SA）on the plant

图2 水杨酸(SA)处理三七植株后对分生孢子萌发的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of salicylic acid（SA）on the germination of inoculum conidium of P.notoginseng

2.2 SA 对三七抗圆斑病的诱导效果

不同浓度SA 处理后，三七圆斑病的病斑直径均显著减小（P＜0.05）。接种7 d 后，对照组的病斑直径为1.65 cm，0.1、0.5、1.0、2.0和4.0 mmol/L SA 处理后的病斑直径分别为1.51、1.48、1.47、1.49 和1.49 cm，分别减小0.14、0.17、0.18、0.16 和0.16 cm。其中，1.0 mmol/L SA 处理后病斑直径最小，说明SA 能诱导三七对圆斑病的抗性，且浓度为1.0 mmol/L 的SA 诱导效果最好。

2.3 SA 诱导三七抗圆斑病的生理生化机制

2.3.1 SA 对三七叶CAT 活性的影响

由图3 可知：对照组采样期内CAT 活性无明显变化；1.0 mmol/L SA 处理三七后，三七叶片中的CAT 活性与对照组相比明显提高，处理第4 天CAT 活性最大，为1 031.22 U/g，是对照组的1.94 倍；接种槭菌刺孢的叶片中CAT 活性呈迅速上升趋势，第4 天活性最高，为1 214.82 U/g，是对照组的2.28 倍，4 d 后CAT 活性迅速下降，第7 天活性为52.02 U/g，低于对照组；SA 处理5 d 后再接种槭菌刺孢的叶片，其第4 天的CAT 活性最高，为对照组的3.16 倍，且直到第7 天CAT 活性依然高于对照组。说明SA 处理能够提高三七体内过氧化氢酶的活性，清除病原物侵染时产生的活性氧，提高三七的抗病性。

2.3.2 SA 对三七叶POD 活性的影响

由图3 可知：1.0 mmol/L SA 处理后，三七叶片内的POD 活性明显升高，在整个采样期间均高于对照组，处理第5 天POD 活性最大，为8 000 U/g，是对照组的1.59 倍；对照组处理的三七叶片中POD 活性呈先缓慢上升后下降的趋势，处理第5 天活性最大，为5 025 U/g；接种槭菌刺孢后，三七叶片内的POD 活性有所升高，在第4 天酶活性最大，为6 408 U/g，是对照组的1.45 倍，但处理期间的POD 活性均低于SA 处理；经SA 处理5 d 后再接菌的叶片，其POD 活性在整个采样期间均高于对照组和只接菌处理，且在处理第4 天POD 活性最大，为8 241 U/g，是对照组的1.86 倍，是只接菌处理的1.29 倍。说明SA 处理能使三七叶片内的POD 活性增强，从而提高三七植株的抗病性。

2.3.3 SA 对三七叶SOD 活性的影响

由图3 还可知：对照组处理在整个采样期内SOD 的活性无明显变化。1 mmol/L SA 处理后，三七叶片中的SOD 活性变化呈现双峰曲线且均高于对照组，分别在第3 天和第5 天达到最大值（258.45 和269.54 U/g）；接种槭菌刺孢的叶片中SOD 活性先升高后下降，在处理第5 天SOD 活性最大，为300.59 U/g，是对照组的1.79 倍；经SA 处理5 d 后再接菌的叶片中SOD 活性先升高后下降，在处理第5 天SOD 活性达到最大，为371.77 U/g，是对照组的2.21 倍，是只接菌处理的1.24 倍，且试验期间其SOD 活性均高于对照组和只接菌处理。说明SA 处理能提高SOD 活性，有利于抑制槭菌刺孢侵染导致的氧自由基增加带来的伤害，从而提高三七对圆斑病的抗性。

图3 不同处理三七叶片中部分生理指标的变化Fig.3 Changes of some physiological indexes in P.notoginseng leaves of different treatments

2.3.4 SA 对三七叶PAL 活性的影响

由图3 可知：1 mmol/L SA 处理后，三七叶片内PAL 活性高于对照组，处理第6 天PAL 活性最高，为71.8 U/g，是对照组的1.35 倍，且处理第7 天的PAL 活性高于第1 天；只接种槭菌刺孢叶片中PAL 活性比对照组高，处理第2 天PAL 活性最高，为67.17 U/g，是对照组的1.48 倍，随后PAL 活性下降，处理第7 天降到最低，为48.99 U/g，低于其他处理；经SA 处理5 d 后再接菌的叶片中PAL 活性也高于对照组，处理3 d后PAL 活性高于只接菌处理，处理第5 天PAL 活性最大，为61.4 U/g，是对照组的1.41 倍。SA 处理后PAL 活性增强说明苯丙烷类代谢是三七抗三七圆斑病的代谢途径之一，SA 处理能够提高三七对圆斑病的抗性。

2.3.5 SA 对三七叶Pro 含量的影响

图3 显示：1 mmol/L SA 处理后，三七叶片中Pro 含量上升，处理第3 天Pro 含量最高，为156.8 µg/g，是对照组的1.52 倍，随后Pro 含量开始缓慢下降，但下降速率没有对照组快；接种槭菌刺孢的叶片Pro 含量较低，第4 天含量最高，为80.15 µg/g，但始终低于其他处理；经SA 处理5 d 后再接菌的叶片Pro 含量比只接菌处理高。说明SA 处理能有效提高三七叶片的Pro 含量，从而诱导三七对圆斑病菌的侵染产生快速高效的反应。

2.3.6 SA 对三七叶MDA 含量的影响

由图3 还可知：1 mmol/L SA 处理后，三七叶片MDA 含量始终保持较低水平，且处理期间均低于对照组。只接种槭菌刺孢的叶片MDA含量升高，处理第4 天含量最高，为42.83 nmol/g，是对照组的1.39 倍，随后下降，但一直保持在较高水平；经SA 处理5 d 后再接菌的叶片中MDA 含量与对照组相比有所升高，但整体均低于只接菌处理。说明SA 处理能降低三七叶片中MDA 含量，有利于增加三七抗病性。

2.4 SA 诱导三七抗病基因PnPR10-1 的表达

由图4 可知：SA 处理三七后，三七叶片中的PnPR10-1基因上调表达。SA 处理3 d 后，Pn-PR10-1基因的表达量为1.325，显著高于对照组（0.994）（P＜0.05）；SA 处理5 d 后，PnPR10-1基因的表达量为1.166，高于对照组（1.082）（P＞0.05）；SA 处理5 d 后再接种槭菌刺孢2 d，PnPR10-1基因的表达量高于对照组（P＞0.05），且低于SA 处理3 和5 d 后的表达量。因此，SA 能诱导早期三七叶片内抗病基因PnPR10-1的表达，从而诱导三七对圆斑病的抗性。

图4 实时荧光定量PCR 分析PnPR10-1基因的相对表达水平Fig.4 Quantitative real-time PCR ayalysis for expression levels of the PnPR10-1

3 讨论

槭菌刺孢是三七圆斑病的病原菌，主要危害三七地上部分，造成严重的经济损失。SA 是一种重要的植物内源激素，在植物生长、发育和抗逆诱导等方面具有重要的生理功能。本研究以三七为试材，施用外源SA 和接种三七圆斑病菌，探究SA 参与调控三七与槭菌刺孢相互作用的机制。结果表明：外源添加SA 显著提高三七对圆斑病的抗性。李红杰[28]的研究表明：外源喷施SA 可降低冬瓜枯萎病病情指数，提高防治效果，以150 g/mL 处理效果最优，防治效果达到78.02%；常雪花等[29]研究了采前SA 处理对甜瓜采后病害及抗性相关酶和防卫物质诱导，发现与对照相比，1.0 mmol/L SA 可以明显推迟甜瓜发病时间，降低发病率和病情指数；王铮等[30]比较不同浓度SA 对田间烟草抗病性的影响，结果表明：SA 诱导的抗性具有广谱性，且防效随着SA 浓度的增加而增加。可见，SA 对不同植物诱导抗性的最佳浓度不同，但总体而言均表现出低浓度可以诱导植物的抗病性，并且对病原菌的生长没有影响。本研究结果与以上研究结果相似，且发现1 mmol/L SA 处理三七的效果最好，可能是由于高浓度SA 对三七产生了毒害作用，具体原因有待进一步探究。

植物感染病原菌后，体内活性氧的代谢平衡受到破坏，过剩的活性氧可引发和加剧膜脂过氧化作用，细胞结构被破坏，代谢系统紊乱，严重时导致植物细胞死亡[31]。因此，植物自身拥有活性氧清除系统，主要由SOD、CAT 和POD 等防御酶组成[32]。PAL 是植物苯丙烷类代谢途径的关键调节酶，可使L-苯丙氨酸加速形成反式肉桂酸，是抗菌物质（木质素、植保素、黄酮素类色素和酚类物质）合成途径的重要限速酶[33]。陈亮等[31]研究表明：对西瓜单一接种枯萎病菌后，植株体内细胞的SOD、POD、CAT 和PAL 活性增高，且其活性变化与西瓜抗病性密切相关；侯茜等[34]研究了西瓜幼苗根系防御酶活性变化与枯萎病抗性的关系，表明POD、PAL 和CAT 活性与西瓜植株的抗病性呈正相关；石亚莉等[35]研究了SA 处理后苹果灰霉病发生情况及与抗病性相关指标的变化，发现SA 处理能够明显提高果肉组织中防御酶（POD 和PAL）的活性。本研究中，三七叶片经1 mmol/L SA 处理后，其SOD、POD、CAT 和PAL 活性均高于对照；SA 处理5 d 后再接菌的叶片SOD 和POD 活性均高于对照组和只接菌处理，CAT 活性在接种槭菌刺孢后第4 天高于对照和只接菌处理，PAL 活性在处理3 d 后高于只接菌处理，处理第5 天PAL 活性达到最大。这与前人的研究较为一致，说明SA 增加了三七的抗病性。

MDA 是膜脂过氧化的产物，与植物对病原体反应有关的氧化应激所造成的细胞损伤程度可以用膜脂过氧化产物来估计，其含量代表细胞膜的损伤程度[36]，所以MDA 常被用做植物受损的生理指标。Pro 在胁迫条件下植物的渗透调节中发挥适应性作用，与植物的抗逆性密切相关[37]。本研究表明：1 mmol/L SA 处理三七植株后，其叶片中MDA 含量与对照组相比下降，Pro 含量与对照组相比增加；SA+槭菌刺孢的处理与直接接种槭菌刺孢的处理相比，MDA 和Pro 含量也呈现同样的规律。说明SA 处理能降低MDA 含量，从而减少对细胞膜的伤害，同时SA 处理能够提高三七叶片中Pro 含量，与汤晓莉等[38]和石亚莉等[35]的研究结果一致。

PR-10 蛋白是植物受到各种生物和非生物胁迫后产生的一类病程相关蛋白，在植物生长发育阶段和应激外界逆境环境时发挥重要作用，PR-10基因几乎可在所有植物器官中表达，响应病原体的入侵和感染[39]。唐美琼等[40]人工接种三七根腐病病原菌后，PnPR10-1基因在三七根组织中的表达量显著增加，并且PnPR10-1基因在三七叶和茎中表达量很高，因此推测该蛋白可能具有广谱抗病性。本研究对SA 处理后的三七叶片进行实时荧光定量PCR 发现：叶片中PnPR10-1基因表达量显著高于对照，说明SA 处理有助于促进三七叶片中PnPR10-1基因的表达，从而诱导三七对圆斑病产生抗性。杨丹等[41]研究发现：PnPR10-2基因对三七根腐病病菌腐皮镰刀菌（Fusarium solani）和毁灭柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）具有一定的抑制作用，推测该基因同样参与三七抗根腐病的防御反应。

4 结论

本研究利用外源添加SA 及人工接种圆斑病菌的方法，验证了SA 能显著提高三七对圆斑病的抗性，还能诱导提高三七防御相关酶活性，有助于促进三七叶片中PnPR10-1基因的表达，且以1 mmol/L SA 处理的效果最佳。研究结果为SA 应用于三七圆斑病的绿色防控奠定了基础，对于提升三七品质和提高经济效益具有重要意义。