UVB 对藏药镰形棘豆类黄酮积累的影响∗

黄聪琳，王晓琳，，郭 敏，，赵晓丽，，姜 华

1 甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2 甘肃省中医药研究院

镰形棘豆Oxytropis falcate Bunge，藏药名为“莪达夏”，作为药材被收载于《中华人民共和国卫生部药品标准（藏药）》第一册，系豆科棘豆属多年生草本植物，主产于青海、甘肃、四川等省份。全草入药，其味辛、性寒，有小毒，入肺、脾二经，具有清热解毒、生肌愈疮、涩脉止血等功效［1］。类黄酮，即黄酮类化合物，作为镰形棘豆的主要药效活性物质之一，具有良好的抑菌［2］、抗炎［3-4］、免疫调节［5-6］等作用。提高黄酮类化合物的含量，对提升镰形棘豆药材质量、药用价值意义重大。

黄酮类化合物是一类重要的植物次生代谢产物，在植物生长发育以及抵抗逆境胁迫的过程中合成积累，并发挥重要的生理作用［7］。其合成代谢是植物中广泛存在的生物化学途径，受到UVB辐射、水分、温度等多种环境因子诱导［8-9］。本研究通过对镰形棘豆幼苗进行不同强度的UVB 辐射处理，分析镰形棘豆黄酮类化合物的含量，以及黄酮合成关键酶的活性，以期确定UVB 对藏药镰形棘豆黄酮类化合物积累的影响，为定向调控镰形棘豆黄酮生物合成提供理论依据，为从药用植物次生代谢产物积累角度阐释药材道地性奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 试验材料以镰形棘豆人工培养植株为试验材料。镰形棘豆成熟种子购自奇正藏药股份有限公司，系甘南藏族自治州合作地区镰形棘豆药材中收集。镰形棘豆植株于人工气候室培养，控制温度16±1℃，光照周期为16 h光照/8 h黑暗。

1.2 UV-B 胁迫处理选取生长良好、长势一致的镰形棘豆30 天幼苗进行UV-B 辐射处理：每天UVB 紫外线照射6 h 处理。紫外灯管为国产，发射光谱区域为280～390 nm。将UVB 灯管架于培养材料上方，通过调节距离幼苗高度实现不同辐射强度的设置，以UVB强度计测定。试验设置低辐照强度Q1（约2.0 W/m2）和高辐照强度Q2（约3.0 W/m2）处理，CK 为无UVB 辐射的正常对照组。处理0、1、2、3、5、7 天后于每天同一时间采样，将幼苗连根铲出，剪去地下部分，称取新鲜质量，迅速保存于-20℃冰箱中，备用。

1.3 仪器与试剂Waters e2695 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；紫外辐射计（台湾tenmars公司）；岛津UV-1800 紫外分光光度计（日本岛津公司）；CP225D 分析天平（德国Sartorius 公司）；高速冷冻离心机（美国Sigma 公司）等。芦丁标准品（中国药品生物制品检定所），鼠李柠檬素对照品由甘肃省中医药研究院中药研究所制备［10］。高效液相色谱试验（high performance liquid chromatography，HPLC）试验用甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 黄酮供试品溶液的制备分别称取UVB 处理0、1、2、3、5、7天的镰形棘豆植株地上部分1.0 g，于研钵中研磨后，置50 mL圆底烧瓶中，加20 mL甲醇，加热回流提取2 h，滤过，滤液补足体积至20 mL，蒸干，残渣用10 mL 甲醇溶解后，加入0.6 mL 浓盐酸，水浴回流1 h，滤过，滤液补足体积至10 mL，作为镰形棘豆供试品溶液。

2.2 总黄酮含量的测定

2.2.1 芦丁标准曲线的制作精密称取干燥至恒重的芦丁对照品7.50 mg 置于50 mL 容量瓶中，加入80% 甲醇20 mL，于30℃水浴锅中加热使之溶解，放冷，用80% 甲醇定容至刻度，摇匀，即得0.15 mg/mL的芦丁对照品溶液。精密量取0、1、0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 芦丁标准溶液于25 mL容量瓶中，分别加入6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0 mL 去离子水；各加5% 亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min；加10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min；加4%氢氧化钠溶液10.0 mL，再加去离子水定容至25 mL，摇匀，放置15 min。第一份作为空白，在最大吸收波长510 nm 处用紫外分光光度计测定吸光度。以芦丁对照品的浓度为横坐标（X），吸光值A 值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算线性回归方程。得到的线性回归方程为：Y=0.5129X-0.0038，相关系数R²=0.9993。

2.2.2 样品测定取1.0 mL 黄酮供试品溶液至25 mL 容量瓶，加5.0 mL 去离子水，加5% 亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min；加10% 硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min；加4% 氢氧化钠溶液10.0 mL，再加去离子水定容至25 mL，摇匀，放置15 min。在510 nm 波长下用紫外分光光度计测定吸光值。分别记录数据，带入求得的线性方程中，计算得出黄酮供试品溶液中总黄酮含量。

2.3 鼠李柠檬素含量测定[10]

2.3.1 对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的鼠李柠檬素对照品15.0 mg，80% 甲醇超声溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度为1.5 mg/mL的对照品溶液。

2.3.2 色谱条件色谱柱为资生堂CAPCELL PAK C18-MGⅡ（4.6 mm×250 mm，5 µm），流动相为0.4%磷酸水溶液-甲醇（30∶70），流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，进样量为20 µL，检测波长为266 nm。在此色谱条件下，样品分离良好，鼠李柠檬素色谱保留时间tR=11.2 min。

2.3.3 线性关系考察分别吸取对照品溶液适量，稀释，得系列质量浓度的对照品溶液。精密吸取20 µL，注入高效液相色谱仪，按“2.3.2”项色谱条件进行测定。以对照品质量浓度（ug/mL）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归处理，得鼠李柠檬素回归方程为：Y=28644.1X+551086.0，R2=0.9981，进样质量浓度37.5～150 µg/m，L 与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 镰形棘豆黄酮合成关键酶活性测定

2.4.1 粗酶液制备取冷冻的镰形棘豆样品，按照固液比1∶4加入预冷的0.05 M Tris-HCl提取缓冲液（pH 8.0，内含20 mM β-巯基乙醇，2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP 和100 µM 碘乙酸），加入少量石英砂，冰浴研磨至匀浆。4℃12 000×g离心15 min，取上清液，作为PAL（摘要处已添加）、CHS（摘要处已添加）、CHI（摘要处已添加）酶活测定的粗酶提取液。蛋白质含量按Bradford方法测定。

2.4.2 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）的活性测定反应体系：反应总体积为1.5 mL，分别为：0.05 M Tris-HCl（pH8.0）850 µL，粗酶液0.5 mL，20 mL-苯丙氨酸150 µL，对照不加L-苯丙氨酸。35℃下反应1 h后，在290 nm处测吸光值。以每小时在290 nm 处吸光度变化0.01 为一个酶活力单位，结果以U/g 新鲜质量表示。

式中：∆A 为1h 内吸光度的差值，V总为酶液总体积（mL），V测为测定时的酶液用量（mL），FW 为样品新鲜质量（g）。

2.4.3 查尔酮合酶（chalcone synthase，CHS）和查尔酮异构酶（chalcone isomerase，CHI）的活性测定取CHS和CHI酶活测定试剂盒，按照试剂盒说明书的方法步骤进行测定。通过标准曲线计算样品CHS和CHI活性。

3 结果

3.1 镰形棘豆黄酮类化合物含量测定通过对镰形棘豆幼苗黄酮类化合物含量进行动态测定，可以看出镰形棘豆总黄酮含量在UVB 辐照处理后显著增加，见图1。低辐照强度Q1处理下，总黄酮含量增长较为平缓；高辐照强度Q2处理下，总黄酮含量增长幅度较大。表明UVB 辐射有提高总黄酮含量的效果。

通过对镰形棘豆幼苗鼠李柠檬素含量的动态测定。鼠李柠檬素含量的增长趋势与总黄酮含量的增长趋势基本一致，两种强度的UVB 辐射，均能够提高镰形棘豆幼苗中鼠李柠檬素的含量。见图1。

图1 UVB处理对镰形棘豆黄酮类化合物积累的影响

3.2 镰形棘豆黄酮类化合物合成相关酶活的测定Q1处理下的PAL酶活高于对照组，呈现持续增长的趋势，PAL酶活最高值出现在UVB辐射处理第3 天，酶活达到对照组的2.18 倍，处理第5 天有小幅度降低。Q2处理下的PAL酶活在UVB辐射1天出现小幅降低后增长，自UVB 辐射处理第3 天开始，PAL酶活开始高于对照组，并迅速于第5天达到最高值，为对照组的1.77倍。试验表明，UVB辐射可以提高镰形棘豆幼苗PAL的活性。见图2。

图2 UVB处理对镰形棘豆苯丙氨酸解氨酶活性的影响

由镰形棘豆幼苗CHS 的活性动态变化可以看出，Q1处理下的CHS 活性历经先增长后降低的过程，但是与对照组相比，仍然高于对照组。UVB 辐射处理第3 天CHS 活性最高，达到对照组的1.90倍。Q2处理下，CHS活性同样经历先增长后降低的过程，但在UVB 辐射第3 天以后，CHS 活性均低于对照组。试验表明，UVB 辐射可以提高镰形棘豆幼苗CHS 的活性，Q1处理的CHS 活性升高效果高于Q2处理的。见图3。

图3 UVB处理对镰形棘豆查尔酮合酶活性的影响

UVB 辐射对镰形棘豆幼苗CHI 的影响见图4。结果显示，Q1处理下，CHI酶活呈现先升后降，而后再上升的趋势，UVB处理第3、5天，CHI活性低于对照组。上升过程中，CHI 酶活最高达到对照组的1.11 倍。Q2处理下，CHI 酶活同样呈现先升后降，而后再上升的趋势，与Q1处理不同的是，除第1 天CHI活性高于对照组，为对照组的1.04倍以外，其他处理时间下，CHI活性均低于对照组。

图4 UVB处理对镰形棘豆查尔酮异构酶活性的影响

4 讨论

黄酮类化合物作为植物类重要的次生代谢产物，在植物生长发育的过程中，受到多种环境因素的影响。UVB 辐射对植物黄酮类化合物含量的调节作用在之前的研究中已经有报道。例如，UVB辐照能够增加大豆芽苗类黄酮含量的增长［11］，持续的UVB 辐射诱导致使马铃薯类黄酮含量不断增加［12］，随着外加UVB 辐射强度增加，凤仙花总黄酮质量分数随之增加［13］。黄酮类化合物是藏药镰形棘豆重要的活性部位，因此黄酮含量是衡量镰形棘豆药材品质的特征之一，鼠李柠檬素是镰形棘豆黄酮类化合物中含量较高的一类。本试验结果表明，镰形棘豆幼苗在受到外源的UVB 辐射后，随着UVB 辐射时间的延长，总黄酮含量与鼠李柠檬素的含量不断增加，UVB 辐射可以提高镰形棘豆的药效成分含量。

UVB 辐射能够增加镰形棘豆类黄酮的含量，黄酮类化合物种类众多，与此对应的生物合成途径与参与的酶类众多。植物类黄酮的生物合成起始于苯丙烷代谢途径，苯丙氨酸解氨酶PAL 将苯丙氨酸转化为合成黄酮的重要底物4-香豆酰-CoA。4-香豆酰-CoA在查尔酮合酶CHS的作用下，与3 分子丙二酰-CoA 结合生成查尔酮，由此将合成途径引向类黄酮的生物合成［14］。PAL 和CHS 是黄酮类化合物生物合成起始的关键酶，CHI 催化查尔酮，使之进入黄酮合成途径的一个分支，我们因此观察测定了PAL、CHS 和CHI 的活性变化。实验结果发现UVB 可以较显著地增强PAL、CHS 的活性，说明UVB 可以有效地促进苯丙烷代谢途径向生成黄酮类化合物的生物途径转化。UVB 对CHI活性影响不明显，说明UVB对由CHI参与合成的这一类黄酮的促进作用不显著，而结合UVB 可以增强鼠李柠檬素含量的结果，也可以间接地说明鼠李柠檬素并不是出自CHI的这一分支。

与此同时，我们发现不同剂量的UVB 辐射对上述三种酶的影响不同。低剂量的UVB 辐射对提高黄酮合成相关酶PAL、CHS 及CHI 的活性效果优于高剂量的UVB 辐射。高剂量的UVB 在辐射前期可增强CHS 及CHI 的活性，而在辐射后期，CHS 及CHI 活性反倒降低，低于对照组。在植株性状上，高剂量的UVB 辐射后期，镰形棘豆植株的茎、叶片出现颜色加深、略微变得干硬。我们推测高剂量的UVB 长时间辐射可能导致叶片的次生代谢组织受到破坏，导致类黄酮合成相关酶的活性受到抑制，CHI对UVB造成的辐射伤害更为敏感。

本试验表明，UVB 辐射对镰形棘豆类黄酮物质的积累有明显的促进作用。UVB 辐射下，类黄酮物质含量增高，也是植物应对避免或减轻UVB辐射造成伤害的一种保护性反应。低剂量的UVB能够刺激镰形棘豆黄酮合成相关酶的活性升高，促进类黄酮的生物合成。然而，高剂量的UVB 长期辐射可能对镰形棘豆幼苗造成不可修复的损伤，不利于类黄酮的积累。本试验探讨UVB 这一西北重要环境因子对镰形棘豆药效物质积累的影响，丰富了药用植物次生代谢积累对药材道地性形成的认识，为定向调控提高镰形棘豆类黄酮含量提供理论依据。为镰形棘豆黄酮合成相关酶功能的进一步研究及类黄酮生物合成途径的解析提供了基础。