济阴颗粒对雌性冠心病大鼠脂代谢的影响

黄 赫，齐 越，王若冰，张 瑜，赵 磊△

1 辽宁中医药大学附属第二医院，辽宁 沈阳 110034；2 江苏省徐州医药高等职业学校

冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）是最常见的心血管疾病［1］，是妇女死亡的主要原因之一［1-2］。相关研究［3-6］表明，绝经前女性冠心病的发病率较低，症状不典型，因此，探讨冠心病的复杂发病机制，尤其是女性冠心病的发病机制已迫在眉睫，而在分子水平上对冠心病进行研究是一种其有前沿性的研究方法［7］。

脂代谢紊乱常伴有血脂生化指标包括血清总胆 固 醇（total cholesterol，TC）、甘 油 三 酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）和/或高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）异常升高［8-9］。脂代谢异常是肝脏、糖尿病、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、高血压和各种心血管疾病的主要危险因素之一［10］。绝经期女性脂质代谢紊乱经常被忽视，与更年期综合征混淆，其具体机制还不明朗。中药复方济阴颗粒由生地黄、淫羊藿、香附、丹参、黄柏组成，主要用于治疗绝经综合征肝肾阴虚证。本研究采用去卵巢雌性冠心病大鼠模型模拟绝经期冠心病大鼠，在分子水平上探究济阴颗粒对绝经期冠心病大鼠脂质代谢的影响，为绝经期冠心病女性脂质代谢紊乱的防治、中药新药研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药健康雌性SD 大鼠75 只，体质量（200±20）g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物合格证号：SCXK（辽）2015-0001。

1.2 试药与仪器RNA 提取试剂RE-03012（FOREGENE 公司，批号：R190701）；反转录试剂盒RR047A［宝生物工程（大连）有限公司，批号：095634］；ABclonal 2×快速荧光定量qRCR 反应预混液（低Rox）RK21202（ABclonal 公司，批号：190601）；大鼠TC ELISA 试剂（上海酶联生物科技有限公司，批号：201912）；Multiskan FC 酶标仪，ABI7500实时定量PCR仪（德国Thermo公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备75只健康SD雌性大鼠适应性喂养7 天后，随机分为空白组、模型组、西药对照组、中药对照组、济阴颗粒组5 组，每组15 只。除空白组外，其余各组大鼠制备绝经期冠心病模型：去除双侧卵巢，术后腹腔注射青霉素（华北制药股份有限公司，批号：F8008502）3 天以防感染，阴道分泌物涂片确定未出现感染后进行冠心病造模：除空白组外所有大鼠每天给予高脂饲料［11］［3% 胆固醇（ 成都华夏化学试剂有限公司，批号：P354464），0.5% 胆酸钠（成都华夏化学试剂有限公司，批号：P436521），0.2% 丙基硫氧嘧啶（成都华夏化学试剂有限公司，批号：P243652），5% 白糖，10% 猪油］连续8 周，造模第7、14 天分别给予维生素D3注射液（江苏吴中医药集团有限公司苏州制药厂，批号：14122501，规格：30 万IU/支，50万IU/支）50 万IU/kg、30 万IU/kg 注射液灌胃，第7 周给予异丙肾上腺素注射剂（上海禾丰制药有限公司，批号：41160302，规格：1 mg/支）（ISO）5 mg/kg多点皮下注射，连续1周［12］。

1.3.2 给药及标本采集西药对照组每日灌服1 次阿托伐他汀钙片（辉瑞制药有限公司，批号：X67405，规格：10 mg/片）2 mg/kg；中药对照组每日灌服1次珍珠灵芝片（湖南正清制药集团股份有限公司，国药准字1903107，规格：0.32 g/片）0.17 g/kg；济阴颗粒组每日灌服1次济阴颗粒［生地黄、淫羊藿、丹参、香附、黄柏免煎颗粒剂（江阴天江药业有限公司，批号：18334517、18112331、19032831、19051161、19032251），规格：10 g/包］7.8 g/kg；空白组、模型组每日1 次灌服同等容积蒸馏水。各组于给药8 周后取材，分离主动脉，液氮速冻后保存在-80℃冰箱。

1.3.3 试剂盒提取大鼠主动脉血管RNA取新鲜组织每10～20 mg 加入500 µL Buffer RL1，玻璃匀浆器或电动匀浆器将组织研磨均匀；将研磨均匀的匀浆液转移至DNA 清洗柱（DNA-cleaning column）中，12 000 r/min（13 400×g）离心2 min。移除DNA-Cleaning Column，保留收集管内上清液；向上述上清液（体积应约为500 µL）中加入1.6 倍体积Buffer RL2（使用前请确认已按照说明加入无水乙醇），轻柔混匀；将700 µL 混合液转移至RNA-only Column 中（纯化柱放入收集管中），12 000 r/min（13 400×g）离心1 min，弃掉收集管中的废液；将纯化柱放回收集管中，将剩余混合液全部加入纯化柱中，12 000r/min（13 400×g），离心1 min，弃掉收集管中的废液；向纯化柱中加入500 µL Buffer RW1，12 000r/min（13 400×g）离心1 min，弃掉收集管中的废液；向纯化柱中加入700 µL Buffer RW2（使用前请确认已按照说明加入无水乙醇），12 000r/min（13 400×g）离心1 min，弃掉收集管中的废液，重复1 次；将纯化柱放回收集管中，12 000 r/min（13 400×g）空管离心2 min，去掉离心柱中残余的Buffer RW2；将纯化柱转移至新的离心管中，向纯化柱的膜中央滴加50～200 µL 已于65℃预热的RNase-Free ddH2O（切勿将洗脱液添加到压圈上，否则会损失较大体积的洗脱液），室温放置2 min。12000r/min（13 400×g）离心1 min 收集RNA 溶液。为提高RNA 产量，可将离心得到的RNA 溶液重新加至纯化柱中，重复步骤1次。

1.3.4 mRNA反转录为cDNA反应反应1：5×gDNase Mix 2.0 µL，Template（RNA）5 µL，RNase-Free ddH2O 3 µL，42℃2 min，4℃+∞；反应2：反应液110 µL，5×ROEasy Mix 4 µL，RNaseFree ddH2O 6 µL，37℃15 min，85℃5 s，4℃+∞。

1.3.5 实时定量PCR反应cDNA 0.4 µL，上游引物（10 µM）0.4 µL，下游引物（10 µM）0.4 µL，2×SYBR Green Fast qPCR Mix with Low Rox 10 µL，ddH2O 8.8 µL，95℃2 min；95℃15 s，60℃1 min，72℃1min，40cycles；95℃15s，60℃1min，95℃15 s，60℃15 s。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.6 ELISA 测定大鼠血清总胆固醇含量标准品的加样：设置标准孔和样本孔，标准品孔加不同浓度的标准品50 µL；加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤相同）；待测样品孔；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释剂40 µL，然后再加待测样品10 µL（样品最终稀释度为5 倍）；加样将样品加于酶标孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；加酶：每孔加入酶标试剂100 µL，空白孔除外；温育：用封板膜封板后置37℃温育60 min；配液：将20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水20 倍稀释后备用；洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，没空加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；显色：每孔加入显色剂A50 µL，再加入显色剂B50 µL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟；终止：每孔加入终止液50 µL，终止反应；测定：以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

1.4 统计学方法所有数据采用SPSS 19.0进行统计学处理，计量资料以±s 表示，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠主动脉ABCA1 mRNA 水平与空白组相比，模型组ABCA1 mRNA表达明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；同模型组比较，西药对照组、中药对照组、济阴颗粒组ABCA1 mRNA 表达显著增加（P＜0.01）。见图1。

图1 大鼠主动脉ABCA1 mRNA表达水平

2.2 大鼠主动脉ApoA1 mRNA 水平与空白组相比，模型组ApoA1 mRNA表达明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；同模型组比较，西药对照组、中药对照组、济阴颗粒组ApoA1 mRNA 表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图2。

图2 大鼠主动脉ApoA1 mRNA表达水平

2.3 大鼠主动脉CAV1 mRNA 水平与空白组相比，模型组CAV1 mRNA 表达明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。同模型组比较，西药对照组、中药对照组CAV1 mRNA表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01），济阴颗粒组CAV1 mRNA 表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 大鼠主动脉C AV 1 m R N A 表达水平

2.4 大鼠主动脉LDLR mRNA 水平与空白组相比，模型组LDLR mRNA 表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。同模型组比较，西药对照组、中药对照组、济阴颗粒组LDLR mRNA 表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图4。

图4 大鼠主动脉LD LR m R N A 表达水平

2.5 大鼠主动脉SRB1 mRNA 水平与空白组相比，模型组SRB1 mRNA 表达明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。同模型组比较，西药对照组、中药对照组、济阴颗粒组SRB1 mRNA 表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图5。

图5 大鼠主动脉S R B 1 m R N A 表达水平

2.6 大鼠主动脉VLDLR mRNA 水平与空白组相比，模型组VLDLR mRNA表达明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。2）同模型组比较，西药对照组、中药对照组VLDLR mRNA表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01），济阴颗粒组VLDLR mRNA表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图6。

图6 大鼠主动脉V LD LR m R N A 表达水平

2.7 大鼠血清总胆固醇含量测定与空白组相比，模型组总胆固醇含量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；同模型组比较，西药对照组、中药对照组总胆固醇含量显著减少，差异有统计学意义（P＜0.01），济阴颗粒组总胆固醇含量减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图7。

图7 大鼠血清总胆固醇含量

3 讨论

近年来，女性冠心病患者的比例持续增长，并且主要为老年妇女［13-14］，女性患冠心病的时间大约比男性晚10 年，潜在的原因可能是绝经前雌激素的保护作用［13，15-16］，65 岁以上的女性患冠心病的风险是65岁以下的女性的3倍［13，17-18］。

小窝蛋白1（caveolin-1，Cav-1）已被报道与脂质代谢有较好相关性［19］。小窝介导脂质的跨膜转运和脂蛋白分子的内吞和外吞［20-21］。除了囊泡介导的脂质转运外，小窝中的各种受体，如LDLR、SR-B1 和ABCA1，介导脂质流出［22］。Cav-1 富含囊泡、内质网和高尔基体，通过囊泡的细胞内沉降在细胞浆和细胞膜之间穿梭［23-24］。脂蛋白受体，如极低密度脂蛋白受体（very low density lipoprotein receptor，VLDLR）和低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR），以及脂质转运蛋白，如ABCA1和SRB1，构成跨膜脂质转运系统［25-28］。脂蛋白，包括极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）和蛋白质胆固醇输送蛋白（cholesteryl ester transfer protein，CETP）构成一个细胞外脂质沉积系统。调节血清脂蛋白受体水平是降低血清胆固醇和甘油三酯的作用机制之一。 载脂蛋白A1（apolipoprotein-A1，ApoA1）是高密度脂蛋白的主要结构蛋白。现有数据表明，ApoA1和ABCA1之间的功能性相互作用对ApoA1 的初始脂肪化是必要的［29］。通过一系列的中间步骤脂肪化的ApoA1形成盘状的HDL 颗粒，可在卵磷脂胆固醇酰基转移酶（lecithin cholesterol acyl transferase，LCAT）的作用下转化为球形颗粒。

脂质代谢在冠心病中起着重要作用［30］。HDL是冠心病的保护因素［31］，LDL 是冠状动脉疾病的危险因素［32］。TC 和TG 水平也与冠心病相关［33-34］。血脂异常是脂质异常转运的直接结果，通过脂质转运蛋白及其受体在脂质转运中发挥关键作用［8］。实时定量PCR结果显示，模型组大鼠ABCA1、ApoA1、CAV1、LDLR、SRB1、VLDLR mRNA 水平显著低于空白组、西药对照组、中药对照组，可能是雌性大鼠患冠心病后脂质转运减少，因此转运相关受体mRNA 相对表达量减少。 济阴颗粒组大鼠ABCA1、ApoA1、CAV1、LDLR、SRB1、VLDLR mRNA 水平高于模型组，可能是给予济阴颗粒后，CAV-1、各种受体如LDLR、VLDLR、SR-B1和ABCA1 mRNA相对表达量增加以介导脂质流出，同时高密度脂蛋白的结构蛋白ApoA1 mRNA 相对表达量增加。ELISA 结果显示，空白组、西药对照组、中药对照组、济阴颗粒组总胆固醇含量低于模型组，因此推测济阴颗粒可能通过降低总胆固醇水平以治疗去卵巢雌性大鼠冠心病脂质代谢紊乱。

中医认为，脂质代谢病是痰湿内阻所致，高脂饮食引起脾胃功能障碍，导致体内脂肪积聚，最终导致痰湿内阻［35］。本研究从脂质代谢角度检测济阴颗粒对去卵巢雌性冠心病大鼠脂质代谢紊乱的疗效，表明济阴颗粒能降低去卵巢雌性冠心病血清TC 水平。对济阴颗粒降脂作用机制的进一步研究表明，济阴颗粒可上调ABCA1、ApoA1、CAV1、LDLR、SRB1、VLDLR mRNA 水平。综上所述，济阴颗粒是一种通过调节载脂蛋白、载脂蛋白受体、脂质转运水平和降低总胆固醇水平而起作用的中药小复方，推测可能对绝经期女性脂质代谢紊乱有一定治疗效果。