响应面法优化四妙勇安汤菌质固态发酵工艺∗

马新换，李季文，毕映燕，王雪梅

甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

四妙勇安汤的处方最先记录于华佗的《神医秘传》，曰“此疾发于手指或足耻之端，先疹然后痛，甲现玄色，久则溃败，节节脱落……内服药用玄参三两，金银花三两，当归二两，甘草一两，水煎服。”清朝医家鲍相敖将此方命名为“四妙勇安汤”，收载于《验方新编》中，并称其医治脱疽“连续十剂，永无后患”［1］。目前临床上不仅仅用四妙勇安治外科脱疽，其在周围血管病科、骨科、眼科也广泛应用［2-9］。真菌发酵可以富集中药成分，不仅可减少药材用量，还可提高疗效［10］。笔者通过查阅相关资料发现，利用药用真菌进行中药发酵亦可组成中药复方，通过其分解转化能力，提高中药中活性成分的单位浓度，且可产生新的活性物质，获取更多的有效成分，共同作用于机体，发挥整体效应［11-13］。本文通过真菌发酵技术，对四妙勇安汤方进行发酵研究，以期实现减少服用量，提高临床疗效的目的。通过本研究初步建立四妙勇安汤方菌质真菌发酵工艺条件，旨在为四妙勇安汤的开发研究提供试验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器仪器YX280A 型手提式不锈钢蒸汽消毒器（上海三申医疗器械有限公司）；SB-5200DTS双频超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；HH-S4 型恒温水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）；MJX-160 型培养箱（宁波江南仪器厂）；HXGZ-000800 电热恒温干燥箱（连云港医疗器械设备厂）；BS110 电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。

1.2 材料真菌菌种由甘肃省中医院科研制剂中心研发部自制。金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb. 的干燥花蕾或带初开的花；玄参为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensisHemsl.的干燥根；当归为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根；甘草为豆科植物胀果甘草Glycyrrhiza inflataBat. 的干燥根和根茎；均由甘肃省中医院科研制剂中心提供，由甘肃省中医院主任中药师李喜香鉴定。

2 方法与结果

2.1 发酵方法

2.1.1 菌种培养将真菌菌种接入121℃、灭菌30 min 的四妙勇安汤方药材培养基中，于25℃下恒温培养15天待菌丝体达到发酵终点，即得。

2.1.2 菌质的制备取金银花、玄参、当归、甘草饮片，破碎，加入适量的蒸馏水，混合均匀，置于100 mL 试管内，盖上棉塞，用包装纸包好，121℃，灭菌30 min。在无菌室内，取制备好的固体种子适量平铺接种到固体培养基中，在适宜的温度、湿度下，培养，至发酵瓶底布满菌丝，即得。

2.1.3 菌丝体生长速度以S 代表每天菌丝生长速度（mm），以菌丝体布满菌质表面开始计算，平行3 份（A1、A2、A3），将发酵瓶圆形面平均分成4 份，分别测定菌丝体生长速度（S1、S2、S3、S4）。计算公式为：

2.2 单因素实验

2.2.1 药材粒径对菌丝体生长的影响按处方比例分别称饮片适量，按照饮片、10目、24目、50目、60 目的要求混合，按“2.1.2”项下方法制备菌质，菌质装至同一高度，菌质条件为含水量为120%，接种量为10%，在27℃，发酵15天。考察不同粒径对菌丝体生长速度的影响。随着目数的增加菌丝体生长速度减慢，结果显示10 目培养基菌丝生长速度快。因此，实验设计中药材粒径选为10目。

2.2.2 发酵时间对菌丝体生长的影响按处方比例分别称饮片适量，按照5、10、15、20、30 天的要求培养，按“2.1.2”项下方法制备菌质，菌质条件为菌质粒径为10 目，含水量为120%，接种量为10%，在27℃，发酵不同天数。考察发酵时间，结果显示15天为最佳发酵时间。

2.2.3 发酵温度对菌丝体生长的影响按处方比例分别称饮片适量，按照20、22、24、26、8℃的要求进行培养，按“2.1.2”项下方法制备菌质，菌质条件为菌质粒径为10 目，含水量为120%，接种量为10%，在按照不同温度，发酵15天。考察发酵温度对菌丝生长的影响，结果显示24℃为最佳发酵温度。

2.2.4 菌质初始含水量对菌丝体生长的影响按处方比例分别称饮片适量，按照初始含水量90%、100%、110%、120%、130% 的要求进行培养，按“2.1.2”项下方法制备菌质，菌质条件为菌质粒径为10 目，接种量为10%，发酵温度为24℃，在按照不同初始含水量，发酵15 天。考察初始含水量对菌丝生长的影响，结果显示100% 为最佳初始含水量。

2.2.5 接种量对菌丝体生长的影响按处方比例分别称饮片适量，按照5%、7%、9%、10%、15% 的接种量要求进行接种培养，按“2.1.2”项下方法制备菌质，菌质条件为菌质粒径为10 目，初始含水量为100%，发酵温度为26℃，在按照不同接种量，发酵15 天。考察初始含水量对菌丝生长的影响，结果显示10%为最佳接种量。

2.3 星点设计-响应面法[14-21]

2.3.1 试验设计与结果根据单因素实验结果，本实验主要研究初始含水量（A）、发酵温度（B）、接种量（C）3 个因素对响应值菌丝生长速度（S）的影响。采用星点设计分析方法，优化工艺条件，并进行预测实验分析。因素水平见表1，试验设计与结果见表2。

表1 因素水平表

2.3.2 模型建立及回归分析采用Design Expert 8.0.6软件，对表2数据进行回归拟合，得回归方程为S=11.02+0.67A+1.39B+2.27C+1.18AB+0.98AC+0.94BC-2.23A2-1.44B2-0.13C2，相关系数R2=0.8169，表明方程拟合情况良好。方差分析见表3。式中S 为菌丝体生长速度（mm），A 初始含水量（%）、B发酵温度（℃）、C接种量（g）。见表3。

表2 菌丝生长速度

从表3 可以看出，模型的P＜0.01，说明该模型得到的回归方程有高度显著性差异，试验设计可靠，模型相关系数R2=0.8169，进一步说明模型具有较好的可信度。在所选取的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序，接种量＞发酵温度＞初始含水量。方差分析的结果表明方程的总模型、发酵温度（B）及接种量（C）对菌丝生长速度的影响有显著性；初始含水量（A）对菌丝生长速度无影响，而交互项AB、AC、BC 对菌丝生长速度的影响不显著。

表3 回归方程的方差分析表

2.3.3 效应面分析响应面优化法即是将实验得出的数据结果进行响应面分析，得到的预测模型一般是个曲面，即所获得的预测模型是连续的。其优势是在实验条件寻优过程中，可以连续的对实验的各个水平进行分析。

2.4 条件优化、预测与验证由图1—3 响应面可知该模型有稳定点，且稳定点是最大值。利用Point Prediction 进行预测分析，获得一组响应值最大的优化条件：初始含水量124.5%，发酵温度为28℃，接种量为10%，在此优化条件下，菌丝生长速度S 为14.94 mm。为了方便实际加水量操作，将发酵工艺参数适当调整为：初始含水量125%，发酵温度为28℃，接种量为10%。在此条件下进行发酵，依法测定菌丝生长速度，对修正结果进行验证，结果菌丝生长速度为14.66 mm（n=3）。预测值与实际值之间偏差不大，说明该工艺参数在菌芪菌质发酵工艺中具有可靠性和重现性。

图1 初始含水量和发酵温度对菌丝生长速度的等高线及响应面图

图2 初始含水量和接种量对菌丝生长速度的等高线及响应面图

图3 发酵温度和接种量对对菌丝生长速度的等高线及响应面图

3 讨论

本试验在研究过程中，通过预实验，明确中药菌质的粒径，并将其粒径确定为10 目，均值太粗，达到发酵终点的时间太长，菌质太细不利于后续的提取。故在确定菌质粒径的前提下，经过发酵天数的观察，明确了发酵15 天可达到发酵终。本试验应用菌株具有分解纤维素、蛋白质、淀粉等成分的作用，在该试验研究过程中有利于富集四妙勇安汤方中的有效成分，在临床使用中减少服用量，同时提高疗效。本试验以四妙勇安汤方药材为菌质对其进行双向固态发酵工艺研究，星点设计-响应面法优化条件结果表明，初始含水量（A）及接种量（C）对菌丝生长速度的影响有显著性；发酵温度（B）对菌丝生长速度无影响，预测值与实际值之间偏差不大，说明该工艺参数在四妙勇安汤菌质发酵工艺中具有可行性。