益气阴祛瘀浊方剂联合全反式维甲酸减轻大鼠子宫内膜纤维化的机制*

庞芹，黄宇，吴敏，覃开羽

(1.柳州市中医医院 妇科，广西 柳州 545000；2.柳州市中医医院 药学部，广西 柳州 545000)

哺乳类动物子宫内膜受到较大损伤或反复损伤时，细胞外基质中的间质纤维结缔组织增生以修复缺损组织，即发生子宫内膜纤维化，严重者可导致不孕不育[1]。已有研究证明，益气阴祛瘀浊方剂可通过抑制纤维化信号通路。转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)-Smad通路和细胞间交流(wingless,Wnt)-β-连环蛋白(β-catenin)通路，可促进子宫内膜生长，抑制子宫内膜纤维化[2]。维甲酸(advanced transit association, ATRA)是动物体内维生素A代谢的中间产物，它具有广泛的生理和药理活性，能激活细胞再生基因，调节细胞增殖、分化和凋亡，可作为一种新型抗纤维化药物[3]。ATRA在既往研究中明确可下调一些肿瘤细胞的金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases，MMPs)表达，如在浸润性前列腺癌细胞中其能够降低80%的MMP-9活性，进而抑制前列腺癌的浸润性，或对宫颈癌和子宫内膜癌中也有一定的作用[4]。益气阴祛瘀浊方剂既往用于对糖尿病、宫腔黏连及子宫内膜微纤维化症等疾病的治疗中，可减少内膜细胞蛋白质的代谢、促进内膜的生长发育及缓解机体炎症反应，对改善子宫内膜微纤维化症、糖尿病等均有明显效果[5]，但临床中尚未明确ATRA或益气阴祛瘀浊方剂对上述疾病的具体作用机制。因此，本研究旨在探索益气阴祛瘀浊方剂联合ATRA对抑制大鼠子宫内膜纤维化的机制，现将结果汇报如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1动物来源 健康成年雌性Wistar大鼠25只，无特定病原体级实验动物(specified pathogen free，SPF)级，年龄10～12周、平均(11.05±0.34)周，体质量200～280 g、平均(234.27±23.19)g，体长15～20 cm、平均(17.81±1.92)cm。专业鼠房5只/笼，室温24～26 ℃，湿度45%～55%，自由饮用水和喂养，日照12 h，通风良好，适应性饲养3 d。

1.1.2主要试剂与仪器 改良Eagle培养基(dulbecco's modification of Eagle's medium dulbecco，DMEM；美国Gibco)，放射性免疫沉淀试验(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(北京索莱宝)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT；美国Sigma)，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS；上海谷研实业)，0.25%胰蛋白酶和3,3′-二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒(美国Sigma)，荧光素Luciferin(美国Xenogen)，无水乙醇(北京滑雪)，苏木素(北京化学试剂)；CXD5-WGP300恒温培养箱(北京中西远大)。

1.2 实验方法

1.2.1造模、分组及取样 选取20只大鼠采用刮勺深入大鼠子宫腔反复轻刮子宫内膜至粗糙构建大鼠子宫内膜纤维化模型，随机均分为手术未给药组、方剂组、ATRA组及联合组，另选5只健康大鼠随机作为正常对照组(常规饲养，不作任何处理)。4组造模大鼠干预方式如下：(1)手术未给药组大鼠造模后采用戊巴比妥钠1 mL/kg灌肠麻醉，常规消毒，将下腹皮肤纵向切开约1 cm进入腹腔，双角子宫位于膀胱后面，直径1 mm的刮宫匙反复轻刮宫腔、缝合；(2)方剂组大鼠按照手术未给药组造模后每日灌肠给予20 mL/kg益气阴祛瘀浊方剂(党参、白术、黄芪、枸杞、生地、黄精、龟板、三棱、莪术、水蛭、地鳖虫、蒲公英及败酱草各5 g熬制为1 000 mL)；(3)ATRA组大鼠造模同手术未给药组，造模后每日灌肠2.5 mg/kg ATRA；(4)联合组大鼠造模后在方剂组给药基础上增加2.5 mg/kg ATRA。4组造模大鼠灌肠青霉素钠40 000 U/d，预防术后感染；方剂组、ATRA组及联合组大鼠给药均1次/d，连续5 d；每天观察大鼠的进食量和活动情况，第6天处死各组大鼠取子宫作后续实验用。

1.2.2苏木素伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色 取各组大鼠子宫标本，石蜡切片，放二甲苯Ⅰ和Ⅱ各10 min，依次无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和95%、90%、80%、70%酒精，静置5 min，蒸馏水清洗；Harris苏木素染3～8 min、自来水洗，1%盐酸酒精分化、自来水冲洗，0.6%氨水返蓝、流水冲洗；伊红染液染色3 min，切片依次放入95%酒精I和II、无水乙醇Ⅰ和Ⅱ、二甲苯Ⅰ 和Ⅱ 各5 min脱水透明，切片取出晾干，中性树胶封片；显微镜下采集图像并分析。

1.2.3Western blot检测子宫内膜细胞TGF-β和β-catenin蛋白表达 刮取各组雌鼠宫腔获得子宫内膜细胞，加蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)和放射免疫沉淀(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解缓冲液，4 ℃孵育30 min，12 000 r/min离心10 min，分离细胞碎片；使用蛋白浓度定量法检测蛋白浓度，加蛋白上样缓冲液煮沸蛋白5 min，聚丙烯酰胺凝胶电泳90 min，湿转法将分离后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，切取目的条带PVDF膜，使用5%脱脂奶粉封闭液于室温下封闭2 h，分别加入一抗TGF-β(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)，4 ℃反应过夜；Tris-HCl缓冲盐溶液(Tris-HCl buffer solution+Tween，TBST)洗膜3次、5 min/次，加对应二抗，稀释比例均为1∶10 000，37 ℃孵育2 h；TBST洗膜2次、10 min/次，以β-actin为参照，电化学发光法显影。

1.2.4实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测大鼠子宫内膜TGF-β和β-cateninmRNA的表达 每只大鼠的样本均做2份平行样(观测样本数=例数×2)；苏木素染色，提取各组大鼠子宫内膜总RNA，用紫外分光光度法测定吸光度(optical delnsity，OD260)，并检测核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)质量；94 ℃ 2 min，94 ℃ 10 s、57 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，40个周期的条件下进行cDNA的反转录；与β-actin相比，得到一个相对值；TGF-β上游引物为5′-CATGGAAGCGCAATGGACT-3′、下游引物为5′-CTGTACCAGACCGAGATGTCA-3′，β-catenin上游引物为5′-ATCAGGCTCAGTCGGGGAATA-3′、下游引物为5′-TGGTCTCGTGTTCTCTGTTCT-3′；利用软件分析数据，计算出相应循环阈值(cycle threshold，Ct)，2-ΔΔCt值表示目的基因的相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 子宫内膜组织学

HE染色结果显示，正常对照组大鼠子宫内膜呈粉红色，血管正常分布，无出血或淤血现象，间质区结缔组织纤维规律排列；手术未给药组大鼠子宫内膜第6天可见出血区，呈突起、透明、结节状、囊性，结缔组织富集，间质内可见少量血管；与手术未给药组相比，方剂组和ATRA组大鼠子宫内膜有不同程度的修复，间质纤维化程度明显减轻；联合组大鼠子宫内膜修复效果尤为明显。见图1。

正常对照组 手术未给药组 方剂组 ATRA组 联合组

2.2 子宫内膜TGF-β、β-catenin蛋白及其mRNA表达

正常对照组大鼠子宫内膜TGF-β和β-catenin蛋白表达均低于手术未给药组，方剂组、ATRA组、联合组大鼠子宫内膜TGF-β和β-catenin蛋白表达均高于正常对照组，且低于手术未给药组，差异均有统计学意义(P<0.05)；方剂组、ATRA组大鼠子宫内膜TGF-β和β-cateninmRNA表达分别较正常对照组和手术未给药组升高(P<0.05)，联合组大鼠子宫内膜TGF-β和β-cateninmRNA的表达与正常对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1和图2。

表1 子宫内膜TGF-β蛋白、β-catenin蛋白及其mRNA表达

图2 各组大鼠子宫内膜TGF-β和β-catenin蛋白表达

2.3 子宫内膜腺体数量和纤维化相对面积

方剂组、ATRA组大鼠子宫内膜腺体数量分别较正常对照组和联合组均减少(P<0.05)，较手术未给药组均增多(P<0.05)，但联合组和正常对照组大鼠子宫内膜腺体数量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；方剂组、ATRA组、联合组大鼠子宫内膜纤维化面积较正常对照组均增多(P<0.05)，较手术未给药组均减少(P<0.05)，且联合组大鼠子宫内膜纤维化面积较正常对照组增多(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠子宫内膜腺体数量和纤维化相对面积

3 讨论

当子宫内膜由于一些原因(例如人工流产、炎症、肿瘤或外源激素等)造成细胞较大或反复损伤并超出功能细胞的再生修复能力时，细胞外基质便会异常增多以保护子宫内膜的相对完整性，但由于其却不具备功能细胞的结构和功能，最终将导致子宫内膜纤维化甚至功能下降[6]。纤维化的形成原因有很多，主要有以下几种[7-9]：(1)细胞外基质异常沉积；(2)细胞分泌能够调节基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)表达的致纤因子，促进炎症，引起组织的反复损伤和修复，形成纤维化；(3)刺激纤维化信号通路，如Wnt/β-catenin信号通路可促进成纤维细胞增殖及细胞外基质合成，抑制细胞外基质降解，促进组织纤维化[10]。

益气阴祛瘀浊方剂是由党参、白术、黄芪、枸杞、生地、黄精、龟板、三棱、莪术、水蛭、地鳖虫、蒲公英及败酱草熬制而来[11]。方中党参味甘，性平，归脾、肺经，可补中益气，治脾胃之虚，补气血两亏；白术味甘，性温，归脾、胃经，可健脾益气、止汗安胎、燥湿利水，为补气虚药物；黄芪味甘，性微温，归肺、脾经，可补气固表、利尿生肌、托毒排脓；枸杞味甘，性平，归心、肾经，可补益精气、润肺滋肾，强盛阴道；生地味甘、苦，性寒，归心、肾、肝经，可清热生津、凉血止血、益精填髓；黄精味甘、性平，归肺、脾、神经，可补气养阴、健脾润肺、益肾；龟板味甘、咸，性微寒，归肾、肝、心境，可滋阴潜阳、养血补心、益肾强骨；三棱味辛、苦，性平，归脾、肝经，可消积止痛、破血行气；莪术味辛、苦，性温，归脾、肝经，可消积止痛、行气破血；水蛭味咸、苦，性平，归肝经，可逐瘀消症，破血通经；地鳖虫味咸，性寒，归肝经，可续筋接骨、破血逐瘀；蒲公英味甘、苦，性寒，归胃、肝经，可消肿散结、清热解毒、利尿通淋；败酱草味辛、苦，性凉，归胃、肝、大肠经，可祛痰排脓、清热解毒[11]。因此益气阴祛瘀浊方剂可补后天养先天，渗湿祛瘀、健脾补肾，改善肾功能，提高机体抗氧化应激效果，在肝脏、心肌等组织纤维化抑制中应用广泛[12]。

ATRA作为维生素A衍生物，能够对细胞基质的形成和细胞的生长分化发挥调解作用，并促进胚胎形成[13]。有学者认为ATRA能够通过下调酪氨酸激酶表达而抑制肝细胞生长因子/酪氨酸激酶介导的子宫内膜癌浸润和转移，进而抑制人子宫内膜癌的增殖等，且近年来也明确其对肝癌等恶性肿瘤均可发挥程度不一的抑癌作用[14]。本研究显微镜下观察各组大鼠宫腔形态，用药组大鼠的子宫内膜颜色、体积、出血斑点等均有不同程度的改善，数据上腺体数量也有所上升，纤维化面积减少，这一结果提示益气阴祛瘀浊方剂联合ATRA共同作用效果尤其明显[15]。但益气阴祛瘀浊方剂还能够促进细胞内蛋白质的合成，促进脂肪组织氧化替代相关蛋白质的氧化，从而通过减少内膜细胞蛋白质的代谢消耗促进内膜的生长发育[16]。TGF-β为一组新近发现的调节细胞生长和分化的细胞因子，能使正常的成纤维细胞的表型发生转化，即在表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)同时存在的条件下，改变成纤维细胞贴壁生长特性而获得在琼脂中生长的能力，并失去生长中密度信赖的抑制作用[17]。近年来TGF-β在治疗伤口愈合，促进软骨和骨修复以及通过免疫抑制治疗自身免疫性疾病和移植排斥等方面有潜在的应用前景[18]。β-catenin是一种多功能的蛋白质和黏附因子，主要位于细胞膜，在胞浆中游离量较少，其功能主要为介导细胞间黏附和参与基因的表达[19]。β-catenin作为一种多功能的蛋白质，广泛存在于各种类型的细胞，如内皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞中，在参与这些细胞的增殖、分化和凋亡等方面均有调节作用，监测TGF-β和β-catenin变化能够了解机体炎症反应情况[20]。

Wnt信号通路是由一系列癌基因以及抑癌基因编码表达的蛋白质组成，能够抑制β-catenin的降解，导致细胞质内的β-catenin增多，引起T细胞因子转录水平提高，促进多种靶基因激活，如原癌基因c-Jun、可异位基因c-myc和基质金属蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-7，MMP-7)等，这些靶基因在肿瘤的生成、发展以及转移中发挥了重要作用[21]。本研究结果表明，益气阴祛瘀浊方剂联合ATRA可通过抑制各种炎症介质，影响TGF-β和β-catenin水平，进而影响Wnt信号通路，起到抑制肿瘤细胞增殖，发挥抗肿瘤效应；通过多途径抑制成纤细胞的活化，发挥抗器官纤维化作用[22]。此外，其对于炎症反应的作用，TGF-β和β-catenin水平的调节，还可以在调节Wnt信号通路的作用下，诱导未成熟、增殖的早幼粒细胞分化为成熟血细胞，促进组织再生。将本文结果与既往研究[23]结合分析发现，益气阴祛瘀浊方剂能抑制子宫内膜间质细胞向肌成纤维细胞的转化，减少胶原的生成，以抗子宫内膜纤维化，同时还可通过下调TGF-β/smad的表达，调节子宫内膜纤维化。

综上所述，本研究发现益气阴祛瘀浊方剂联合ATRA均可抑制TGF-β和β-catenin的表达，还可通过增殖腺体数量减少大鼠子宫内膜纤维化面积。