新型三维网格宫内节育器对猕猴子宫内膜 ER、PR和PAX2影响

于建春 张美华 于 玲 宋 霞 邱 毅

山东大学附属山东省妇幼保健院，国家卫生健康委生育调控技术重点实验室(济南，250014)

放置IUD的副作用或并发症主要有IUD移位和排出、子宫穿孔、月经失血增加、疼痛以及置器后子宫或盆腔发炎和异位妊娠[1-5]。研究认为，IUD的形状、大小和重量对避孕效果及副作用的发生有很大影响[2,5]，因此需要对IUD形状、大小、重量及体积进入研究。释放孕酮类的IUD对子宫雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)的表达有下调节作用[6-7]。配对盒子基因2(PAX2)是一种致癌基因，参与子宫内膜癌的发展。最近的免疫组织化学研究表明，子宫内膜增生中PAX2缺失表达的发生随着子宫内膜癌变过程中的恶性进展而增加[8-10]。目前少见IUD作为避孕方法对猕猴子宫内膜PR、ER和PAX2表达影响的研究。笔者为猕猴设计并制造了一种新型的镍钛(Ni-Ti)和硅橡胶三维网格宫内节育器(3-DG IUD)，观察猕猴子放置后子宫内膜的变化等。

1 材料和方法

1.1 3-DG IUD 和放置器

3-DG IUD 的框架由镍钛合金丝线(直径0.05 mm)构成，且覆盖一层硅橡胶；设计大号和小号两种，小号3-DG IUD上端横径长度0.4 cm，下端横径长度0.3 cm，高度0.6 cm，支架厚度0.2 cm；大号3-DG IUD上端横径长度0.8 cm，下端横径长度0.6 cm，高度1.2 cm，支架厚度0.4 cm。放置器材质为不锈钢，外套管直径2.5mm，推杆直径2.3mm[11]。

1.2 动物

猕猴来自福建省非人灵长类动物实验中心。所有饲养程序均按照《福建省实验动物饲养使用指南》进行，并经福建省计划生育科学技术研究院动物饲养使用委员会批准。2016年12月，成年雌性猕猴20只分为3-DG IUD组(9只)、假手术组(9只)、对照组(不手术，2只)。动物护理和使用的许可证号为SYXK(Min)2015-0007和SCXK(Min)2015-0002。所有猕猴均采用标准喂养的单笼。

1.3 外科手术

无菌条件下进行。猕猴用硫酸阿托品(0.02 ml/kg肌内注射)和盐酸氯胺酮(0.1～0.2 ml/kg肌内注射)镇静，腹部剃毛，置于仰卧位。下腹部区域用75%乙醇和碘酒消毒，并用消毒过的布巾覆盖。然后进行手术中线下腹部切口，暴露子宫。将放置器插入子宫，3-DG IUD组将3-DG IUD置入子宫腔，7只放置大号3-DG IUD， 2只放置小号3-DG IUD；假手术组仅将放置器插入子宫腔，未放置3-DG IUD。用可吸收缝线缝合子宫切口，接受预防性抗生素(头孢唑啉，30 mg/kg)治疗3d。

1.4 观察期和超声检查

术后第10天，3-DG IUD组(n=9)和假手术组(n=9)18只雌性猕猴与可育雄性猕猴按1:1配对，观察避孕效果。术后第3个月3-DG IUD 组中2只猕猴和对照组中的1只猕猴(1号)行子宫切除术。术后12个月3-DG IUD组6只猕猴和对照组1只猕猴(2号)接受子宫切除术。每个月对18只猕猴(3-DG IUD组9只，假手术组9只)进行腹部超声检查(探头频率3.5 MHz，X300PE超声检查仪，德国西门子)，了解子宫、3-DG IUD和妊娠情况。

1.5 组织学和免疫组织化学检测

切除子宫用于组织学和免疫组织化学检查。苏木精和伊红(HE)染色，对子宫内膜进行组织学检查。免疫组化检查：①石蜡包埋的组织切片；② 抗原修复；③单克隆抗 ER和抗 PR孵育，洗涤；④山羊抗小鼠/兔二抗和生物素化辣根过氧化物酶复合物(UltraSensitiveTMSP Mouse/Rabbit IHC Kit Maixin Bio) 孵育。对于 PAX2，样本在65℃下干燥1 h，脱蜡、再水化和表位修复，染色观察，苏木精复染。样本与 DAB孵育 5 min，盖玻片覆盖，显微镜观察。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况

3-DG IUD组(n=9)和假手术组(n=9)猕猴体重和月龄分别为(6.4±1.0)kg和(129.6±1.6)个月和(6.5±0.8)kg、(130.8±8.4)个月，两组均无统计学差异(P>0.05)。另外2只雌性对照猕猴(未手术)的体重和月龄分别为5.9kg和127个月，以及6.9kg和132个月。

2.2 妊娠情况

3-DG IUD组仅术后3个月后发现1只猕猴(1/9)3-DG IUD丢失(小型)并妊娠。假手术组术后3个月和12个月分别有6只(6/9)和3只(3/9)猕猴妊娠，与3-DG IUD组差异有统计学意义(χ2=5.844，P=0.05；χ2=14.400，P<0.001)。

2.3 组织学变化

术后3个月和12个月猕猴均未发生盆腔感染。子宫切除术后，切开子宫可以看出，3-DG IUD 没有粘附到周围组织或嵌入子宫肌层(图1A，2013页)。对照组猕猴(1号)子宫内膜是正常基质中的直管状腺体(图1B，2013页)。3-DG IUD 植入3个月组织学检查见子宫内膜上皮完整(图1C、D，2013页)；间质细胞水肿、短梭形且致密；少数腺体弯曲并呈空泡状；螺旋动脉增生(图1C，2013页)。3-DG IUD置入12个月，子宫内膜上皮成份大部分完整，可见少量中性粒细胞浸润，一些腺体分泌液泡；基底层及浅表肌层可见玻璃体变性；间质螺旋小动脉发育良好(图1D，2013页)。

2.4 免疫组化染色分析

免疫组化染色分析显示，对照组(2号)和 3-DG IUD 组子宫内膜腺体细胞核和细胞质ER、PR和PAX2表达状态正常，未见表达缺失、增加和减少。见图2(2013页)。

3 讨论

本研究使用镍钛合金丝设计编制了猕猴用3-DG IUD，观察了猕猴放置3-DG IUD的子宫变化。猕猴的子宫形状像倒梨形和三角形，与人类相似，只是大小不同(比人类小)。因此，猕猴等非人灵长类动物可能是宫内节育器(IUD)实验的最佳动物模型。不同尺寸的 3-DG IUD 专为猕猴设计。IUD与宫腔的尺寸兼容性非常重要。本研究术后 3 个月时，1只(1/9)猕猴排出了小型3-DG IUD。术后12个月后6只(6/6)猕猴3-DG IUD仍在子宫内且未受孕。因此，IUD的尺寸太小，容易脱落，导致避孕失败。

本研究中，猕猴放置3-DG IUD后，组织学检查见子宫内膜仅有螺旋动脉增生，少量腺体空泡，少量中性粒细胞浸润。这些可能只是由3-DG IUD对子宫内膜的局部压迫引起。据报道，慢性子宫内膜炎症的组织学特征在猕猴子宫中放置裸铜线避孕后也有发生[12]。慢性和非特异性子宫内膜炎症是 Cu-IUD 的避孕效果之一。

在本研究中，3-DG IUD 组术后 12 个月子宫内膜 ER、PR 和 PAX2 的 表达与对照组相似。PR和ER的表达在3-DG IUD组中没有上调或下调。据报道，LNG-IUS可以降低子宫内膜中ER和PR的表达，抑制子宫内膜增殖[13]。IUD 局部释放的LNG对ER和PR有抑制作用，这可能有助于此类 IUD 的避孕效果，也可能是LNG-IUS引起的不规则出血和闭经的原因[14]。

在本研究中，置入3-DG IUD后PAX2表达正常，无降低、缺失或过表达。PAX2 是类固醇激素受体信号通路的下游基因。它在子宫内膜癌和良性子宫内膜增生中过度表达[15]。

综上所述，在本研究中，猕猴放置3-DG IUD12个月的避孕效果较好。3-DG IUD置入后，子宫内膜上皮ER、PR和PAX2的表达无明显变化，仅少数中性粒细胞在3-DG IUD周围浸润。因此，猕猴放置3-DG IUD是安全有效的。