基于Nfr2/HO-1信号通路探讨清肺止咳方对急性支气管炎模型小鼠的影响

朱珊， 田新磊， 赵文锦

(1.河南中医药大学 第二临床医学院， 河南 郑州 450000； 2.河南省中医院 儿科， 河南 郑州 450000)

急性支气管炎是儿科常见的呼吸系统疾病之一，主要是由各种致病原所引起的气管、支气管黏膜感染，以咳嗽为主要临床表现[1]，其基本病理机制为气道的急性炎症.现代研究认为炎症与氧化应激反应二者是相互依存的[2]，在炎症的发生和发展过程中，白介素-1β(interleukin-1，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)等促炎因子，可促使吞噬细胞、巨噬细胞等细胞活化产生大量的体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)，可杀灭各种病原体以减轻机体的炎症反应，然而一旦ROS产生过多，又可引起局部氧化应激反应甚至组织损伤，进而激活各种与炎症反应有关的信号通路，诱导甚至促进炎症的发生.细胞核抗氧化因子(nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2)/血红素加氧酶(heme oxygenase-1，HO-1)通路是已被证实的与机体器官的抗氧化应激损伤有关的主要通路之一[3]，其下游产物HO-1与氧化应激反应密切相关，可促进IL-10(interleukin-10，IL-10)等抗炎因子的释放，同时抑制IL-6、IL-1β等促炎因子的释放，具有调节炎症相关细胞因子表达的作用，进而发挥抗感染、抗氧化作用，是一种经典的抗氧化剂.Nrf2能促进HO-1的表达，降低细胞内ROS水平，阻止与急、慢性炎症性疾病相关的巨噬细胞过度活化[4].

急性支气管炎的西医学治疗主要以对症处理为主，但是本病临床具有反复性，容易引起机体免疫功能的紊乱，影响儿童的健康，故西医学治疗优势不明显.中医治病以“整体观念”为指导，标本兼治，不仅能缓解症状，而且能提高机体的免疫力，在治疗本病时具有独特的优势.我国著名儿科专家李晏龄教授根据小儿“阳常有余”的体质特点和“风为百病之长”的致病特点，认为临床上小儿咳嗽以风热型最为多见，故而创立了由黄芩、连翘、桑白皮、葶苈子、炙紫菀、茯苓、丹参、五味子、甘草等组成的清肺止咳方，其临床疗效显著.本课题通过测定急性支气管炎模型小鼠肺组织中Nfr2、HO-1蛋白表达水平及IL-1β、IL-6积分光密度值，基于抗氧化应激角度，探讨Nfr2/HO-1信号通路在急性支气管炎中的病理机制；通过分析不同药物对模型小鼠肺组织Nfr2、HO-1、IL-1β、IL-6的影响，评价清肺止咳方的疗效，为该方的临床应用提供实验室依据.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 实验动物

选用健康4周龄SPF级昆明种小鼠80只，雌雄各半，体质量(20±2)g，购买于河南省实验动物中心，合格证号：0008476，实验经河南省中医院伦理委员会批准.

1.1.2 主要试剂与仪器

Nfr2试剂盒、HO-1试剂盒、IL-1β试剂盒、IL-6试剂盒均购置于美国Santa Cruz 公司；SP9001试剂盒、DAB显色试剂盒、BCA蛋白质量浓度测定试剂盒(增强型)、RIPA组织细胞快速裂解液均购置于北京索莱宝科技有限公司；β-actin (批号：CP10399) 购自美国Abnova公司；凝胶成像系统(CSL-MDOCUV 1D型，通用实验科技有限公司)、显微镜(DM2500型，德国LEICA公司)、电泳仪(1658003型，美国Bio-Rad公司)、酶标仪(RT-2100C型，上海攸茜实业有限公司)、石蜡切片机、包埋机、组织脱水机等均由河南省中医院中心实验室提供.

1.1.3 实验药物

清肺止咳方主要成分：黄芩、连翘、桑白皮、葶苈子、炙紫菀、茯苓、丹参、五味子、甘草等，由河南省中医院药剂科制备成药液，每毫升药液约含2 g生药.

小儿清热止咳口服液主要成分：麻黄、炒苦杏仁、石膏、甘草、黄芩、板蓝根、北豆根等，由荣昌制药(淄博)有限公司生产，批准文号：国药准字Z20143014.该药处方收载于《中华人民共和国药典》(2005版)，主要用于治疗小儿外感、邪毒内盛、发热恶寒、咳嗽痰黄、气促喘息、口干音哑、咽喉肿痛等，疗效确切，应用广泛.

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与造模

将购买的80只小鼠常规(室温26 ℃,湿度55%)饲养3 d后，根据随机数字表分为模型组64只和正常组16只(每组雌雄各半).根据《实用中医证候动物模型学》等相关文献介绍，自制烟熏箱采用改良烟熏法(烟叶、刨花)刺激模型组小鼠制备急性支气管炎模型(每次30 min，每日2次，共1周)[5]，正常组小鼠常规饲养.造模结束后，随机从两组中各选4只小鼠，取其肺组织，进行HE染色，检测病理形态学表现，鉴定模型制备成功与否.

1.2.2 再次分组及干预方法

模型制备完成后，将正常组小鼠12只常规饲养.模型组60只小鼠随机分为5组，即空白模型组，小儿清热止咳口服液组,清肺止咳方低、中、高剂量治疗组，每组12只，雌雄各半；所有小鼠每日进行灌胃治疗1次，共计1周.其中正常组、空白模型组小鼠给予生理盐水灌胃(0.027 mL·g-1·d-1)；治疗组予相应药物灌胃，清肺止咳方低、中、高剂量治疗组予清肺止咳方灌胃(0.009 mL·g-1·d-1、0.018 mL·g-1·d-1、0.027 mL·g-1·d-1)，根据《中药新药研究指导原则》灌胃量分别为临床用药量的10、20、30倍；小儿清热止咳口服液组灌胃量为0.009 mL·g-1·d-1.给药期间由于灌胃不当，空白模型组、清肺止咳方高剂量组小鼠各死亡1只.

1.2.3 标本采集

灌胃治疗1周后，将全部小鼠禁食12 h(自由饮水)，分别称量体质量后，颈椎脱臼处死小鼠.结扎小鼠主支气管，分离取出双侧肺组织，将左侧肺组织，置入4%多聚甲醛溶液中固定；另剪取右侧肺组织，用无菌纱布包裹置于液氮中，转移至-80 ℃冰箱中保存.

1.2.4 免疫组化法检测肺组织IL-1β、IL-6积分光密度

具体操作按照免疫组化试剂盒说明书进行.将4%甲醛固定的肺组织，常规脱水进行石蜡包埋，石蜡包埋后制备厚度4 μm切片，烤片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱二甲苯，蒸馏水冲洗，PBS缓冲液冲洗后在3% H2O2溶液中浸泡，蒸馏水冲洗后放置于枸橼酸盐缓冲液中加热至沸腾后冷却至室温，进行抗原修复，冷却冲洗后，加入封闭液，37 ℃反应30 min，滴加相应抗体(V抗体∶V抗体稀释液=1∶100)，4 ℃过夜；再次冲洗后滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃反应30 min，室温下DAB显色20 min后蒸馏水冲洗，复染，冲洗，脱水干燥，二甲苯透明，树胶封片.在高倍视野下，细胞膜呈棕黄色着色为阳性细胞，用Image pro plus v6.0图像分析系统测定阳性细胞积分光密度.

1.2.5 Western blot法检测小鼠肺组织Nfr2、HO-1蛋白表达水平

剪取一小块右侧肺组织，置入RIPA裂解液中，充分混匀，超声4次，每次10 s，然后放置冰上30 min，4 ℃、14 000 r/min离心15 min，然后收集上清液，提取总蛋白.根据BCA蛋白定量结果上样，每泳道30 μg蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，至溴酚蓝标记跑至胶底上方1 cm处；电泳后，30 V电压过夜转膜15 h，20%甲醇活化；PVDF膜置入0.05 g/mL脱脂奶粉溶液以最慢速度摇床封闭2 h，4 ℃过夜孵一抗(V一抗∶V一抗稀释液=1∶2 000)；取出条带，TBST洗6次，5 min/次，置入二抗+3%脱脂奶粉溶液，以最慢速度摇床，常温2 h孵育二抗；曝光取出条带，TBST洗6次,5 min/次，曝光显影.采用BIO-RAD Image Lab软件对蛋白表达进行分析，蛋白表达水平为目的条带与β-actin内参条带吸光度值的比值.

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 模型制备结果及鉴定

模型制备完成后，正常组小鼠反应活泼，体质量增加，毛色亮泽；模型组小鼠出现打喷嚏、咳嗽症状，伴有精神萎靡、扎堆、眯眼、挠鼻、毛色暗淡、体质量增长缓慢或下降等.取各组小鼠肺组织制备病理切片，经HE染色后于光镜下进行鉴定：正常组小鼠肺组织内气管、肺泡、肺间质结构正常，上皮细胞正常；模型组小鼠气管和支气管黏膜明显充血，间质毛细血管扩张，肺泡及纤毛上皮细胞细胞损伤、脱落，黏液腺体增生，黏膜下层可见中性及淋巴细胞浸润，符合支气管炎病理表现(图1).结合模型组小鼠的临床表现可判定模型制备成功.

A：正常组；B：模型组.A:The normal group;B:The model group.

2.2 不同药物及浓度对小鼠肺组织IL-1β、IL-6积分光密度的影响

各组小鼠肺组织IL-1β、IL-6免疫组化切片结果判读：高倍镜下，细胞膜呈棕黄色的为阳性细胞，阳性细胞越多，提示IL-1β、IL-6积分光密度越高.其中正常组与各治疗组小鼠肺组织中的IL-1β、IL-6的积分光密度均低于模型组，具有统计学差异(P<0.05)；清肺止咳方低、中、高剂量组小鼠肺组织IL-1β、IL-6的积分光密度均低于小儿清热止咳口服液组，且均具有统计学差异(P<0.05)；清肺止咳方低、中、高剂量组组间相比无统计学差异(P>0.05，图2).

a：各组小鼠肺组织IL-1β免疫组化染色结果(×400)；b：各组小鼠肺组织IL-1β积分光密度；c：各组小鼠肺组织IL-6免疫组化染色结果(×400)；d：各组小鼠肺组织IL-6积分光密度. A：正常组；B：空白模型组；C：小儿清热止咳口服液组；D：清肺止咳方低剂量组；E清肺止咳方中剂量组；F清肺止咳方高剂量组.1)与空白模型组比较，P<0.05；2)与正常组比较，P<0.05；3)与小儿清热止咳口服液组比较，P<0.05.

2.3 不同药物及浓度对小鼠肺组织Nfr2、HO-1蛋白表达的影响

与模型组相比，正常组与各治疗组小鼠肺组织中的Nfr2、HO-1的蛋白表达水平均升高，且具有统计学差异(P<0.05)；清肺止咳方低、中、高剂量组小鼠肺组织Nfr2、HO-1的蛋白表达水平均高于小儿清热止咳口服液组，且各组与小儿清热止咳口服液组相比均具有统计学差异(P<0.05)；清肺止咳方低、中、高剂量组之间相比无统计学差异(P>0.05,图3).

a：各组小鼠肺组织Nrf2、HO-1蛋白表达的Western blot结果；b：各组小鼠肺组织Nrf2蛋白相对表达水平；c：各组小鼠肺组织HO-1蛋白相对表达水平. A：正常组；B：空白模型组；C：小儿清热止咳口服液组；D：清肺止咳方低剂量组；E清肺止咳方中剂量组；F清肺止咳方高剂量组.1)与空白模型组比较，P<0.05；2)与正常组比较，P<0.05；3)与小儿清热止咳口服液组比较，P<0.05.

3 讨论

急性支气管炎的发病机制与氧化应激反应密切相关[6].当呼吸道黏膜受到炎症刺激时，可产生大量的活性氧，过多的活性氧可破坏体内的氧化还原平衡，诱发细胞的氧化应激反应，引起黏膜细胞损伤甚至凋亡[7]，进而导致急性支气管炎、肺炎等呼吸道相关疾病的发生.Nrf2/HO-1信号通路不仅具有抗感染、抗氧化作用，而且还能调控细胞的凋亡、自噬，对抗和修复氧化应激反应引起的局部损伤，进而防治呼吸系统相关疾病[8].其中Nrf2可以与氧化反应元件蛋白结合，从而激活和上调抗氧化蛋白的表达，提高机体组织的抗氧化能力和氧自由基的清除能力，而且能下调机体组织对氧化应激反应的敏感性，进而维持机体组织的正常生理功能.另一方面，它同时可以抑制组织释放IL-1β、IL-6、金属蛋白酶等促炎物质[9]，因此，Nrf2是氧化应激反应过程中的重要调控因子之一.HO-1是一种经典的抗氧化剂，它能够催化血红素的降解，通过降解血红素促进机体组织释放IL-10等抗炎因子，不仅可以清除氧自由基，而且可上调、激活抗凋亡蛋白的表达，抑制氧化反应，另一方面在降解过程中，能够产生较多的CO，CO可以抑制IL-6、IL-1β等促炎因子的释放[10]，进而减轻炎症反应.因此HO-1能够抑制氧化应激及炎症反应，同时参与多种疾病的发生、发展，具有调节炎症相关细胞因子表达的作用，与氧化应激反应密切相关.IL-6是诊断肺部感染炎症的重要实验室指标之一，它可以激活炎症反应以及免疫反应，参与宿主细胞的防御应激反应，加速疾病进展，并且能够维持免疫反应，其作为促使各种炎症发生的关键细胞因子，得到了目前临床上的公认[11].IL-6水平的下调，可以改善急性呼吸窘迫综合征大鼠肺水肿及炎症反应[12].IL-1β属于IL-1细胞因子家族，它可以通过诱导、参与表达ROS的中性粒细胞的活化，促使产生过量的ROS，从而损伤肺上皮细胞，加重炎症反应[13]，是炎症反应的一种重要介质.本研究的实验结果显示，正常组与各治疗组小鼠肺组织中IL-1β、IL-6的积分光密度均低于模型组，其中以清肺止咳方治疗组降低最为明显；正常组与各治疗组急性支气管炎模型小鼠肺组织中Nfr2、HO-1的蛋白表达水平均高于模型组，以清肺止咳方治疗组升高最为明显，可以进一步说明在急性支气管炎产生的病理环节中，IL-1β、IL-6具有明显的促炎作用，而Nfr2、HO-1具有很好的抗炎作用.同时也表明清肺止咳方、小儿清热止咳口服液均能有效治疗急性支气管炎模型小鼠，且清肺止咳方疗效优于小儿清热止咳口服液.

急性支气管炎可归属于中医学“咳嗽”的范畴.《幼幼集成》曰：“……咳嗽属脾肺者居多，以肺主气，脾主痰故也.”指出咳嗽的主要病位在于肺、脾两脏.《医方集解·补养之剂第一》载“脾者，万物之母也，肺者，气之母也，脾胃一虚，肺气先绝”，因此“肺脾相关”理论对肺系疾病的诊断及治疗有重要的指导意义[14].

我国著名儿科专家李晏龄教授根据小儿脏腑相对娇嫩，藩篱稀疏不固，容易被外邪所侵袭，加之其“阳常有余”的体质特点，认为小儿感邪最易化热，然“风为百病之长”，故指出临床上以风热型咳嗽最为多见.基于此，创立了清肺止咳方，该方是由黄芩、连翘、桑白皮、葶苈子、炙紫菀、茯苓、丹参、五味子、甘草等组成.方中黄芩擅长清泄肺火和上焦实热，连翘既能疏散外感邪风，又可解毒清热，二药合用，表里双清共为君药；桑白皮、葶苈子相须为用，功专泻肺平喘，炙紫菀化痰止咳，茯苓善健脾渗湿，四者合用止咳平喘，健脾化痰，泻贮痰之器，绝生痰之源，共为臣药；丹参活血祛瘀，使血行气生，五味子益气生津敛肺，二者共为佐药；甘草，益气补脾，调和诸药，为使药.小儿清肺止咳方前期进行的动物实验研究结果表明其具有明显的止咳、祛痰、抗感染的作用，可以调控Th1和Th2细胞亚群的平衡来抑制气道炎症，从而减少炎症反应的发生及致病因素对肺组织的损伤；前期临床观察表明，该方的临床有效率为96.77%[15].

现代药理学研究表明，黄芩的主要有效成分中的黄酮类化合物，具有抗感染、抗氧化、提升机体免疫力等作用[16]；连翘的水提物连翘酯能够上调细胞因子Nrf2的特异性表达，促进其下游的抗氧化蛋白HO-1表达，进而降低细胞内ROS水平[17]；桑白皮的提取物具有抗感染、抗病毒、抗氧化、抗过敏及免疫调节等药理作用[18]；葶苈子中含有的槲皮素和β-谷甾醇等有效化合物可通过MAPK等靶标蛋白而有效抑制支气管及肺组织炎症的产生，激活机体的免疫应答系统，减少促炎介质的释放及黏液的生成，缓解气道的阻塞症状[19]；紫菀中所含有的紫菀酮、紫菀皂苷等均具有很好的祛痰作用[20]；茯苓中所含的茯苓多糖能够提升机体的免疫水平，改善机体因免疫力低下产生的诸多问题[21]；丹参提取物中的丹参酮IIA可以上调HO-1的表达，减少机体产生ROS[22]；五味子中的五味子乙素能够抑制炎症反应和氧化应激反应的发生，同时能抑制NF-κB通路的激活[23]；甘草中的甘草多糖能降低腺病毒、柯萨奇病毒等呼吸道常见病毒的吸附力，并能够减弱病毒进入细胞的能力，起到保护细胞的作用[24].

中药具有减轻机体炎症反应以及抑制氧化应激等作用，这在中医临床应用和药效机制等不同层面均有大量的研究文献支持.其中，Nfr2/HO-1信号通路是急性支气管炎治疗的一个靶点.随着现代社会经济的发展，人类的生活环境和生活习惯也发生了改变，儿科的疾病谱也随之发生了改变，其中不典型病原体所引起的急性支气管炎发病率也逐渐升高，西医特异性药物的研发需要较长周期，而中医学临证强调“辨证论治”，辨病与辨证相结合，三因制宜，加之中药材来源充足，服用方便，应用优势明显.本实验结果中，清肺止咳方低、中、高剂量3组小鼠的肺组织中IL-1β、IL-6积分光密度及Nfr2、HO-1的蛋白表达水平之间比较无统计学差异，表明清肺止咳方在治疗急性支气管炎模型小鼠时不存在剂量依赖性.因此运用中医药防治小儿咳嗽(急性支气管炎)具有较大的优势和发展前景，同时运用现代分子医学理论及现代药理学研究理论可阐明中医药的作用机制，这为其临床应用提供了可靠的实验室依据.本研究是以临床疗效为基础进行的实验研究，结果表明该方治疗急性支气管炎的机制可能与通过Nfr2/HO-1信号通路调节炎症因子水平有关，其更深入的作用机制有待进一步探索.

作者贡献声明

朱珊：提出研究思路和框架，修改论文；田新磊：设计实验、统计分析数据，撰写论文；赵文锦：实验操作，统计分析数据.

利益冲突声明

本研究未受到企业、公司等第三方资助，不存在潜在利益冲突.