CD8、Foxp3和CD1a在口腔潜在恶性病变中的表达及临床意义

刘奕， 肖力， 曹佩琳， 李雪*

(1. 电子科技大学附属医院∥四川省人民医院 口腔科， 四川 成都 610072；2.加拿大英属哥伦比亚大学 牙学院 口腔生物医学科学系，加拿大 温哥华BC V6T1Z3)

口腔潜在恶性病变(oral potentially malignant disorders，OPMDs)是一类被归为具有癌变潜能，发生在口腔黏膜的疾病总称[1]，具体包括：口腔白斑(oral leukoplakia, OLK)、口腔扁平苔藓(oral lichen planus, OLP)、口腔黏膜下纤维化(oral submucous fibrosis, OSMF)、口腔红斑(oral erythroplakia)、尼古丁口炎(nicotine stomatitis)、吸烟相关的口腔黏膜角化(tobaccopouch keratosis)等[1].其中大约有5%～18%的OPMDs可转变为口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinomas，OSCCs)，且若伴有中重度异常增生，病变癌变的可能性更高[2].虽然OPMDs演变为OSCC的确切机制尚不明确，但目前有一个相对一致的认识：它的发生和发展是一个多阶段、多步骤、多种因素变化的复杂病理过程，且临床尚无有效的预防和阻断方法.因此，OPMDs的早期评估和诊断，持续监测与及时干预对于降低口腔黏膜上皮癌变的发病率有重要的临床意义.

目前诊断OPMDs的金标准仍是活检，在没有分子标记使临床医生能够区分病变是否可能进展的情况下，上皮异常增生的程度仍然是口腔潜在病变进展的最佳指南，上皮发育不良被认为更有可能在以后发展为癌症[3-4].基于组织学层面分析，在OPMDs向OSCCs发展的期间，往往将上皮细胞异常增生视为高风险影响因素，但某些OPMDs，诸如OLP，其组织学分析检查结果虽然显示常未合并上皮异常增生现象，但OLP仍具有恶变潜能，其癌变率为1%～5.3%[5-6].目前对这些上皮异常增生的组织学表现评价还缺乏客观指标，故迫切需要寻找有效的生物学标记物来评判OPMDs患者的恶变潜能和风险度，从而对OPMDs进行预后判断及对口腔癌的发生进行风险评估[7].

由肿瘤间质及各类邻近组织细胞、免疫分子、多种免疫细胞、微血管构成的肿瘤微环境，是肿瘤细胞生活的独特环境[6-8].本课题组分析，当OPMDs中异常增生细胞发生转变时，免疫系统中的免疫细胞和细胞因子可能会感受到这一变化，并对细胞这一转变做出反应.在本研究中，课题组采用回顾性分析法从组织学角度着手分析在口腔黏膜不同状态，以及在OPMDs的各阶段时，CD8、Foxp3以及CD1a的表达水平，统计数据分析免疫细胞在口腔潜在恶性病变中上皮异常增生的不同发展阶段时的变化情况，OPMDs阶段相同时各免疫细胞间的相互关系，以及各变化与主要临床因素之间的相互关系，分析免疫细胞在口腔黏膜癌变期间的表达与其临床价值，为OPMDs与OSCC的预防和早期治疗研究给予有关的理论指导.

1 资料和方法

1.1 病例收集

本研究所选用的甲醛固定石蜡包埋(formalinfixed paraffin-embedded，FFPE)活检标本来自于加拿大温哥华总医院病理科数据库(1996-2015)，共计57例OPMDs患者(女27名，男35名)的62例标本.所有选定的患者在最初诊断后均至少有5年的观察期，标本均严格遵循病例纳入和排除标准，患者其他部位无肿瘤病史[4].本研究的审批机构为加拿大UBC伦理委员会(H17-02031)、四川省人民医院医学伦理委员会[编号：伦审(研)2017年第178号].

1.2 主要试剂与仪器

一抗Foxp3 (236A/E7)购自英国Abcam公司，一抗CD8 (C8/144B)和CD1a(010)和二抗均购自丹麦DAKO公司，Pannoramic MIDI切片扫描仪和Panoramicviewer分析软件均购自匈牙利3D Histech公司，显微镜(BH2-RFCA型)购自日本Olympus公司.

1.3 研究方法

1.3.1 样本制备和染色分析

借助组织微阵列技术(tissue microarray，TMA)制备OPMDs的FFPE样本(图1)，固定好石蜡块后，用直径为2 mm的中空细针在石蜡块所选主要病变区域打孔，将细针切取下来的实验样本转移到新的石蜡块上按一定顺序排成阵列，再对TMA石蜡块行切片处理，所得切片控制为4 μm的厚度，且各蜡块标本皆切取4张切片，通过常规苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色方法进行染色分析，病变发展区域的选择及病理检查诊断的结果均由两名高年资病理科医生来确认完成，实验分组结果如下：上皮组织增生17例为上皮增生组，OLP 21例为OLP组，轻度上皮异常增生(mild epithelial dysplasia)15例为D1组，中度上皮异常增生(moderate epithelial dysplasia)9例为D2组[4].

1.3.2 研究病例临床资料分组

研究病例的病理分型依据染色分析结果进行分组，临床资料按年龄、性别、病变部位、饮酒史、吸烟史、病理分型进行分组统计，分组情况详见表1.

表1 研究病例临床资料Table 1 Clinical pathological information of study cases

1.3.3 免疫组织化学染色技术检测CD8、Foxp3和CD1a的表达情况

对TMA石蜡切片进行脱蜡后水合处理(二甲苯2×15 min, 100%乙醇25 min, 95%乙醇×5 min，85%乙醇×5 min，85%乙醇×5 min，75%乙醇×5 min，蒸馏水洗×5 min)，切片置于装满枸橼酸钠抗原修复缓冲液(pH=9.0)中，100 ℃水浴20 min进行抗原修复，再放入0.5%过氧化氢溶液中作用5 min以消除内源性过氧化物酶活性，10%山羊血清封闭切片10 min，滴加一抗抗体(不同抗体按不同比例稀释，实验条件详见表2)孵育，之后在室温中对HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗实施孵育处理，计时40 min.玻片置于pH为7.4的PBS(磷酸盐缓冲液)中，摇床上晃动洗涤脱色3次，每次5 min.每张切片上皆滴加即时制备的DAB显色液(0.04%)，借助光学显微镜管理组织显色，若显示棕黄色，即为阳性，自来水冲洗切片终止显色，苏木素复染，脱水，中性树胶封片.此项研究的阳性对照为正常的扁桃体组织染色，PBS取代一抗当作研究中的阴性对照.Pannoramic MIDI切片扫描仪对免疫组织化学染色(immunohistochemistry，IHC)切片进行扫描分析，Panoramic viewer软件进行分析[4].

IHC染色结果的判读方法：定位区域出现的棕黄色或黄色颗粒被判定为阳性细胞，不着色则被评判为阴性细胞.同时在显微镜(BH2-RFCA型)下观察上皮内及上皮下固有层2个区域[4].采用双评分半定量积分法对IHC染色结果进行评分：即根据染色强度与阳性细胞所占比例计分判断.借助高倍镜(×400)，随机确定5个视野，各视野细胞量≥100个，基于染色强度计分：若未见染色，为0分；若显示淡黄色，为1分；若显示棕黄色，为2分；若显示深棕色，为3分，若评分>0，那么判定染色阳性；按阳性染色细胞比例的平均值分为4个等级：0分-阳性细胞≤10%，1分-11%～30%，2分-31%～60%，3分-阳性细胞≥60%[4].结果评定由2名高年资的病理科医师在独立条件下进行.

表2 抗体的基本信息和实验条件

1.4 统计分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，多样本组间比较采用单因素方差分析，两组样本间检测则采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义．

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2 结果

2.1 HE染色结果和IHC染色结果分析

图2为OPMDs各组的HE和IHC染色结果，HE染色结果中可清楚地见到OLP组织的固有层中密集的淋巴细胞浸润带.基于细胞染色分值和染色阳性率来统计分析CD8、Foxp3和 CD1a的IHC染色结果，分别对各细胞在OPMDs不同阶段中的阳性染色率进行组间比较，具体结果详见表3.

图2 CD8、Foxp3和CD1a在各病理组织中的染色图片(×200)

表3 CD8、Foxp3和CD1a在OPMDs组织间的表达Table 3 Expression of CD8, Foxp3 and CD1a in different pathological tissues of OPMDs

(1)CD8 CD8在OPMDs各组中的IHC染色分析结果显示：CD8+染色定位在细胞质，阳性细胞显示较深染色，绝大部分阳性染色处于上皮下固有层内，在D2组与OLP组内表达量升高，细胞染色阳性率表现出显著不同(P=0.007 6<0.05)；在上皮内仅有OLP组和D2组中低表达CD8，细胞染色阳性率差异无统计学意义(P=0.056 0>0.05).

(2)Foxp3 Foxp3染色阳性细胞呈圆形，散在于淋巴细胞中，表达主要集中在上皮下固有层内，上皮增生组、OLP组、D1组及D2组的Foxp3阳性染色率分别为17.65%、61.90%、13.33%、77.78%，其中，上皮增生组与D1组内显示Foxp3弱阳性表达，但在OLP组与D2组内表达量升高，表现出显著区别(P=0.000 5<0.05).

(3)CD1a CD1a染色阳性细胞主要集中上皮内，仅少量表达于在上皮下，不规则的细胞形态呈长短不一的树枝状突起.在上皮内，上皮增生组和D2组中CD1a的表达呈强阳性，且染色阳性率差异有统计学意义(P=0.023 5<0.05)；而在上皮下固有层内，CD1a在D2组中表达增强，但差异无统计学意义(P=0.281 3>0.05).

经过分析可知：从OPMDs的轻度上皮异常增生发展到中度上皮异常增生的阶段，CD8和CD1a在上皮内的染色阳性率均增加，但在上皮下组织内，所有免疫细胞(CD8、Foxp3和CD1a)的阳性表达率均出现不同程度的上升.另外，OLP组虽然上皮异常增生率低，但在上皮下组织中，相较上皮增生组和D1组，所有免疫细胞(CD8、Foxp3和CD1a)在OLP组中的染色阳性率均明显增高，和在D2组中的表达趋势一致.

2.2 免疫细胞标记物的表达与临床资料的关系

同样，依据CD8、Foxp3和CD1a在上皮内和上皮下的染色分值和染色阳性率结果，对其阳性表达水平与不同临床资料的组间分析结果发现：CD8阳性表达与主要临床因素(年龄、性别、部位、吸烟饮酒史)均无相关性(P>0.05，表4)；Foxp3阳性表达和性别因素存在相关，差异有统计学意义(P=0.039 7<0.05，表5)；定位于上皮内的CD1a阳性表达与病变部位相关，差异有统计学意义(P=0.008 4<0.01，表6).

表4 CD8表达与OPMDs患者临床资料的关系Table 4 Comparison of CD8 expression in the patients with OPMDs of different demographic and clinical characteristics

表5 Foxp3表达与OPMDs患者临床资料的关系

3 讨论

OSCCs是人类头颈部最常见的恶性肿瘤，具有较高的发病率和死亡率，并且5年生存率很低，每年全球有50万新发病例，中国是OSCCs高发国家之一[9-10].OPMDs是发生在口腔黏膜、具有癌变潜能的疾病总称，其组织学表现谱内最末端是原位癌，只是此类癌细胞被局限于基底膜，没有出现侵犯，但实际上已出现了癌变.所以，对于原位癌需考虑如下问题：上皮异常增生组织癌变究竟开始于何时[11]？目前，针对这方面的研究存在一定的困难，因此，在缺乏特异性分子标记物的情况下，研究上皮异常增生的变化对研究OPMDs的进展具有重要的指导作用.常见的口腔黏膜疾病OLP也归属于OPMDs范畴，研究者发现OLP是研究慢性炎症和癌症之间的关系的一种良好模型，且到目前为止，尚无预防OLP恶变的方法[12-13].因此，如果可挖掘出更为可靠、灵敏的新型生物标志物，借助分子生物学检查为及时评估OPMDs恶变潜能开辟新路径，初期实施OPMDs的形成与恶性转化测定，在临床中会极大有助于降低OPMDs的癌变率与OSCCs的发病率[6].

加拿大英属哥伦比亚大学牙学院Dr. Poh Catherine实验室提供的OPMDs和OSCCs的冷冻和存档手术样本包含了疾病从正常到上皮异常增生再到癌变的多个阶段的变化，利于分析口腔上皮细胞及其在肿瘤进展过程中的免疫微环境的空间(肿瘤内位置)和时间(从癌变前到癌变)的动态变化.由于这项研究的样本量有限，课题组仍在继续收集OPMDs和OSCCs标本并对研究病例进行随访，以进一步确认免疫生物标志物在OPMDs和OSCCs进展中的诊断和预后作用.由于实验中所使用的石蜡标本保存时间长达二十年之久，样本组织小，获取困难，故课题组使用了传统的免疫组化单染技术，免疫组化单染法灵敏性和染色结果较强，结果判读容易.近些年来免疫组化双染技术被逐渐推广，染色结果背景清晰且色彩对比鲜明，良好的双染结果有利于病理医师对肿瘤组织学结构的判读，进行对比性、相关性观察，从而得到更加客观和准确的诊断结果.因此在后续的研究中，课题组拟采用双重和多重标记免疫组化染色技术对免疫细胞在OPMDs和OSCCs组织中的表达规律进行进一步的研究，现今课题组经由预实验持续总结经验、完善与改进实验方法，从而充分保障IHC双染以及多重染色的质量[14].

在CD4+T细胞中，CD4+CD25+调节性T细胞具有重要作用，能够预防自身免疫性疾病，抑制机体过度的免疫反应和神经系统病变[18-20].现今认为，CD4+CD25+调节性T细胞能够经由T细胞间的互作、生成抑制性细胞因子、抗原呈递细胞(antigen presenting cell, APC)修饰、细胞间的直接接触等释放免疫抑制作用[21].大部分研究证实，产生的细胞因子促进转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β与白细胞介素(interleukin, IL)-10是其释放效能的主要途径[22].Foxp3+调节性T细胞除了参与肿瘤免疫外，亦可发挥肿瘤抑制基因的功能[23-24].本研究通过免疫组化检测口腔潜在恶性病变组织中Fox3+调节性T细胞的表达，发现Foxp3阳性细胞分散于淋巴细胞中，其表达主要集中在上皮下固有层内，Foxp3基本不在上皮内表达.Foxp3在OLP组和D2组中呈强阳性表达，即说明随着上皮异常增生程度越高，Foxp3+调节性T细胞表达增加.本研究的发现表明Foxp3的阳性表达增加发生在OLP组和D2组，正如CD8的阳性表达趋势，本课题组推测Tregs可能抑制由细胞因子(例如IL-6)产生的炎症的促肿瘤作用，但是，它们可能相反地抑制局部病变中CD8+的过度浸润，以保持CD8+和调节性T细胞之间的平衡.IL-10主要发生在调节性T细胞免疫抑制固有免疫系统效应细胞的过程中，其主要作用就是抑制APC功能[25].通过相关技术去除TGF-β、IL-10后将能使调节性T细胞免疫抑制活性得到一定提升[26].本课题现今只经由IHC测定Fox3+调节性T细胞的表达，存在一定的局限性，后续研究将分析不同病人外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞亚群的比例，进一步确定CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在作为评估口腔粘膜组织恶性转化潜能的指标的可行性.此外，已有研究证实，在维持外周细胞CD4+CD25+调节性T细胞增殖与免疫抑制活性方面，IL-2起着关键作用，作为IL-2的受体，IL-2受体α链(IL-2Rα)，也有“CD25分子”，经由IL-2/IL-2R转导信号极大有助于Treg细胞生长发育[27].

DCs对肿瘤抗原具准确识别能力，同时向免疫细胞传递信息，其抗肿瘤免疫反应的核心机制是DCs产生以CD8+T细胞为主的细胞免疫应答，这也是DCs作为免疫治疗手段的基础.DCs与T细胞对细胞异常增生和口腔黏膜白斑病和肿瘤的恶变的应答，提示异常增生的上皮细胞和癌细胞得到免疫激活[28-29]，然后肿瘤相关的抗原特异性CD8+T细胞识别并消除癌细胞[25].与这些数据相一致，本课题组最近证明，与上皮增生组和D1组相比，OLP组和D2组中CD1a的阳性表达升高.

本研究提示：总体来说，当癌变风险随上皮异常增生程度增高而升高时，几乎所有免疫细胞(CD8、Foxp3和CD1a)的阳性表达率均出现不同程度的上升，这表明这些免疫细胞作为评价恶变转化潜能的指标具有一定的指导意义.但是，因本研究入选病例数限制以及缺少重度上皮异常增生或口腔鳞状细胞癌组织，对于这些免疫细胞作为评价恶变转化潜能的指标的临床指导价值还需要更深入的研究探讨.关于免疫细胞在OPMDs癌变过程中的作用，仍然存在许多悬而未决尚难解决的问题，我们希望通过了解口腔癌和癌前组织内的免疫特征，找到潜在的重要标志物，探寻口腔癌中免疫细胞与肿瘤细胞之间如何发生相互作用的机制，以期能明确鉴定出将发展为癌症的高风险癌前病变状态；并在现有的影像技术检测之前明确需要其他辅助疗法的侵袭性肿瘤并预测淋巴结受累情况，评估肿瘤对免疫疗法可能发生的反应，以减少口腔中的复发和/或第二原发肿瘤.通过现成的价格便宜的分子诊断方法及明确的术语和分类，或许可阐明OPMDs和OSCCs的关系，并了解更多有关上皮角化、伴发或未伴发上皮的异常增生、不同程度的上皮异常增生、原位癌及浸润癌的基因组序列改变的信息，为临床提供更好的干预措施依据以降低OSCCs的发病率和死亡率，并最终为患者带来更好的管理.

致谢

特别感谢加拿大英属哥伦比亚大学牙学院Dr. Poh Catherine实验室提供病理标本以及实验上的帮助.

作者贡献声明

刘奕：协助提出研究思路和框架，收集资料文献，实施实验，撰写及修改论文；肖力：参与设计实验、统计分析数据，修改论文；曹佩琳：协助参与实验的实施以及分析数据；李雪：提出研究思路和框架，设计实验，修改实验方案，分析数据，修改论文.

利益冲突声明

本研究未受到企业、公司等第三方资助，不存在潜在利益冲突.