LncRNA TUG1 通过miR-145/ KIAA1199 轴对结直肠癌细胞转移和上皮间质转化的影响
2022-01-19李海强沈徐宁蒋红钢
李海强 李 彦 沈徐宁 蒋红钢
浙江省嘉兴市第一医院胃肠外科，浙江嘉兴 314000
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是最常见的癌症之一，近年来CRC 发病率和死亡率迅速上升，5 年生存率很低[1-2]。因此，迫切需要有效的CRC 治疗策略。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一组内源性非编码转录本，长度超过200 个核苷酸[3]，在细胞生长和肿瘤发生等多种过程中发挥作用。有文献证明，lncRNA 参与CRC 进展，如下调lncRNA CRNDE抑制CRC 细胞增殖[4]，lncRNA ANCR 结合EZH2 调节CRC 侵袭和转移[5]。TUG1 是最近发现的一种lncRNA，可能在不同的肿瘤中发挥抑癌基因或癌基因的作用[6]，如LncRNA TUG1 靶向微RNA-145（microRNA-145，miR-145）影响甲状腺乳头状癌细胞迁移和EMT 形成[7]；lncRNA-TUG1/EZH2 轴通过miR-382 促进胰腺癌细胞增殖、迁移和EMT 表型形成[8]。然而，TUG1 在结直肠癌变过程中的作用尚未被鉴定。因此，本研究主要探讨LncRNA TUG1 对Colo320 细胞发展的影响及其作用机制。
1 材料与方法
1.1 临床样本
收集浙江省嘉兴市第一医院（以下简称“我院”）2020 年8 月至2021 年2 月经病理诊断证实的、术前未接受放化疗的30 例CRC 患者癌组织及癌旁组织（距癌组织5 cm）标本。男18 例，女12 例；年龄34～80 岁，平均（57.00±9.56）岁；分化程度：低分化3 例，中分化19 例，高分化8 例；TNM 分期：Ⅰ期5 例，Ⅱ期15 例，Ⅲ期6 例，Ⅳ期4 例。本研究通过我院伦理委员会批准，患者及家属知情同意。
1.2 主要材料
Colo320、HCT116 和NCM460 细胞购于中国科学院上海细胞库；DMEM 培养基购于美国HyClone 公司（货号：SH30243.01B）；荧光定量PCR 试剂盒购于大连宝生物有限公司（货号：RR096A）；Transwell 小室购于Millipore 公司（批号:PIHT30R48）；TUG1 siRNA、KIAA1199 siRNA 等质粒购于北京擎科生物公司；miR-145 抑制剂、miR-145 模拟物购于Genepharma 公司；E-cadherin 抗体购于英国abcam 公司（批号：ab40772、ab163528）。
1.3 Colo320、HCT116 和NCM460 细胞培养
培养皿中加入含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100U/ml 链霉素的DMEM 培养基，培养Colo320、HCT116和NCM460 细胞，汇合度达95%左右时传代培养。
1.4 Colo320 细胞转染及分组
胰酶消化对数生长期的Colo320 细胞，将细胞悬液铺于12 孔板，用Turbofect 将质粒转染Colo320 细胞，孵育48 h 后收集细胞进行后续实验。转染后的细胞分组为：①下调对照组、TUG1 下调组、KIAA1199 下调组；②TUG1 野生型（LncRNA TUG1 wt）+miR-145模拟物组、LncRNA TUG1 wt+模拟物对照、LncRNA TUG1 突变型（LncRNA TUG1 mut）+模拟物对照组和LncRNA TUG1 mut+miR-145 模拟物组；③过表达对照+模拟物对照组、TUG1 过表达+模拟物对照组、过表达对照+miR-145 模拟物组、TUG1 过表达+miR-145 模拟物组；④下调对照+抑制剂对照组、TUG1 下调+抑制剂对照组、下调对照+miR-145 抑制剂组、TUG1下调+miR-145 抑制剂组。
1.5 CCK-8 法
CCK-8 法检测转染后Colo320 细胞活力，将细胞铺于96 孔板中，每组设置3 个复孔，24、48、72 h 后PBS 清洗3 次，每孔加入10 μl CCK-8，孵育2 h，酶标仪450 nm 处读取吸光度。
1.6 双荧光素酶报告基因活性检测
双荧光素酶报告基因活性检测LncRNA TUG1与miR-145 的相关性，构建LncRNATUG1wt 和LncRNA TUG1 mut 载体。取对数生长期的Colo320 细胞铺于12 孔板中，细胞密度为75%左右时，LncRNA TUG1 wt、LncRNA TUG1 mut 分别与miR-145 模拟物、模拟物对照在Turbofect 作用下共转染至Colo320 细胞，孵育48 h 后检测荧光素酶活性。
1.7 细胞侵袭实验
200 μl Matrigel 添加至Transwell 上室，静置使其干燥成胶状。胰酶消化转染成功的Colo320 细胞，200 μl 细胞悬液加入上室，下室添加400 μl 含10%胎牛血清的DMEM 培养基，持续培养24 h，4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫浸染，高倍视野（200×）下观察细胞侵袭情况。
1.8 RT-qPCR 检测LncRNA TUG1、miR-145 和KIAA1199的基因表达
转染成功的Colo320 细胞培养48 h 后，加入Trizol提取细胞和组织RNA，反转为cDNA，以cDNA 为模板进行RT-qPCR 检测。程序为预变性95℃、10 min，变性95℃、10 s，退火60℃、20 s，延伸72℃、30 s，40 个循环。每组设有3 个重复，GAPDH 为内参，2-△△Ct法分析结果。引物见表1。
表1 引物序列
1.9 Western blot 检测上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关蛋白E-cadherin、Ncadherin、Vimentin、Snail 及KIAA1199 表达
全蛋白提取试剂盒提取组织和细胞蛋白，BCA 法检测蛋白浓度。蛋白经10%SDS-PAGE 凝胶电泳后转移到PVDF 膜，封闭3 h，加入特异性一抗4℃过夜孵育，二抗37℃孵育2 h，TBST 清洗干净，蛋白曝光后进行灰度分析，重复实验3 次。
水稻秧苗机械化栽插过程中，结合不同秧苗状态，可以将水稻插秧机分为洗苗型、带土型和两用型，按照机械的动力来源不同，可以将水稻插秧机分为人力和机动两种。对于以家庭为单位的农户来说，为了切实保证秧苗状态、促进秧苗成活，一般选择两用型人力水稻插秧机。而对于大型农田或规模化种植户，为了节省人力、减少人工成本投入、提高插秧效率，大多选择两用型机动水稻插秧机。
1.10 统计学方法
采用SPSS 17.0 软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验；两组间比较采用t 检验。以P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 癌组织和癌旁组织中LncRNA TUG1、miR-145、KIAA1199 表达比较
癌组织中LncRNA TUG1 表达量为（3.56±1.17），高于癌旁组织的（1.37±0.85），差异有高度统计学意义（P <0.01）。癌组织中miR-145 表达量为（0.49±0.04），低于癌旁组织的（1.26±0.52），差异有高度统计学意义（P <0.01）。癌组织中KIAA1199 表达量为（3.24±1.08），高于癌旁组织的（1.21±0.76），差异有高度统计学意义（P <0.01）。
2.2 Colo320、HCT116 和NCM460 细胞中LncRNA TUG1、miR-145、KIAA1199 表达比较
HCT116 细胞LncRNA TUG1 表达量为（2.08±1.02），Colo320 细胞LncRNA TUG1 表达量为（2.67±0.92），NCM460 细胞LncRNA TUG1 表达量为（1.15±0.06）；HCT116、Colo320 细胞中LncRNA TUG1 表达量高于NCM460 细胞中LncRNA TUG1 表达量，差异有高度统计学意义（P <0.01）。
HCT116 细胞miR-145 表达量为（0.62±0.07），Colo320 细胞miR-145 表达量为（0.43±0.09），NCM460细胞miR-145 表达量为（1.43±0.23）；HCT116、Colo320细胞中miR-145 表达量低于NCM460 细胞中miR-145 表达量，差异有高度统计学意义（P <0.01）。
HCT116 细胞KIAA1199 表达量为（1.89±0.85），Colo320 细胞KIAA1199 表达量为（2.76±1.03），NCM460细胞KIAA1199 表达量为（1.28±0.21）；HCT116、Colo320细胞中KIAA1199 表达量高于NCM460 细胞中KIAA1199 表达量，差异有高度统计学意义（P <0.01）。
2.3 LncRNA TUG1 对Colo320 细胞的增殖、侵袭及EMT 的影响
培养24、48、72 h，TUG1 下调组细胞活力低于下调对照组，差异有统计学意义（P <0.05），见图1A。TUG1 下调组细胞侵袭数目低于下调对照组，差异有统计学意义（P <0.05），见图1B。TUG1 下调组N-cadherin、Vimentin 和Snail 表达低于下调对照组，E-cadherin表达高于下调对照组，差异有高度统计学意义（P <0.01），见图1C。
图1 LncRNA TUG1 对Colo320 细胞的增殖、侵袭及EMT 的影响
2.4 LncRNA TUG1 与miR-145 的关系
图2 LncRNA TUG1 与miR-145 的结合位点
2.5 LncRNA TUG1 通过miR-145 对Colo320 细胞的侵袭、增殖及EMT 的影响
TUG1 过表达+模拟物对照组细胞侵袭数目高于过表达对照+模拟物对照组，差异有高度统计学意义（P <0.01）；过表达对照+miR-145 模拟物组细胞侵袭数目低于过表达对照+模拟物对照组，差异有高度统计学意义（P<0.01）；TUG1 过表达+miR-145 模拟物组细胞侵袭数目高于过表达对照+miR-145 模拟物组，差异有高度统计学意义（P <0.01）。见图3A。
培养24、48、72 h，TUG1 过表达+模拟物对照组细胞活力高于过表达对照+模拟物对照组，差异有统计学意义（P <0.05）；过表达对照+miR-145 模拟物组细胞活力低于过表达对照+模拟物对照组，差异有统计学意义（P <0.05）；TUG1 过表达+miR-145 模拟物组细胞活力高于过表达对照+miR-145 模拟物组，差异有统计学意义（P <0.05）。见图3B。
TUG1 过表达+模拟物对照组N-cadherin、Vimentin、Snail 表达高于过表达对照+模拟物对照组，E-cadherin 表达低于过表达对照+模拟物对照组，差异有高度统计学意义（P<0.01）。过表达对照+miR-145模拟物组N-cadherin、Vimentin、Snail 表达低于过表达对照+模拟物对照组，E-cadherin 表达高于过表达对照+模拟物对照组，差异有高度统计学意义（P <0.01）。TUG1 过表达+miR-145 模拟物组N-cadherin、Vimentin、Snail 表达高于过表达对照+miR-145 模拟物组，E-cadherin 表达低于过表达对照+miR-145 模拟物组，差异有高度统计学意义（P<0.01）。见图3C。
图3 Lnc RNA TUG1 通过miR-145 对Colo320 细胞的增殖、侵袭及EMT 的影响
2.6 LncRNA TUG1 通 过miR-145 对KIAA1199 表达的影响
TUG1 下调+抑制剂对照组KIAA1199 表达低于下调对照+抑制剂对照组，下调对照+miR-145 抑制剂组KIAA1199 表达高于下调对照+抑制剂对照组，TUG1 下调+miR-145 抑制剂组KIAA1199 表达低于下调对照+miR-145 抑制剂组，差异有高度统计学意义（P <0.01）。见图4。
图4 LncRNA TUG1 通过miR-145 对KIAA1199 表达的影响
2.7 KIAA1199 对Colo320 细胞的增殖、侵袭及EMT 的影响
培养24、48、72 h，KIAA1199 下调组细胞活力低于下调对照组，差异有统计学意义（P <0.05），见图5A。KIAA1199 下调组侵袭数目低于下调对照组，差异有高度统计学意义（P <0.01），见图5B。KIAA1199下调组N-cadherin、Vimentin、Snail 表达低于下调对照组，E-cadherin 表达高于下调对照组，差异有高度统计学意义（P <0.01），见图5C。
图5 KIAA1199 对Colo320 细胞的增殖、侵袭及EMT 的影响
3 讨论
研究显示[9-12]，lncRNA 在调节肿瘤过程中发挥关键作用，lncRNA TUG1 高表达促进卵巢癌细胞增殖、迁移[13]；LncRNA TUG1 通过调控miR-132-3p/SIRT1减轻脂多糖诱导的小肠上皮细胞损伤[14]。Li 等[15]研究显示，LncRNA TUG1 在人脑胶质瘤中发挥肿瘤抑制作用。在不同的肿瘤中，LncRNA TUG1 发挥了不同的生物学功能。本研究结果显示，TUG1 在癌组织、Colo320、HCT116 细胞中高表达。TUG1 在Colo320 细胞转移过程中是发挥癌基因的功能，本研究通过siRNA技术为实验结果提供了依据，表明LncRNA TUG1 对于CRC 发展至关重要。
研究显示[16-18]，LncRNA 能够靶向结合miRNA 参与肿瘤的发展。本研究使用miRcode 数据库预测TUG1 与miR-145 之间存在结合位点，结果显示LncRNA TUG1 wt+miR-145 模拟物组荧光素酶活性低于LncRNA TUG1 wt+模拟物对照（P <0.01）。TUG1 基因过表达促进了Colo320 细胞的发展，而过表达miR-145 逆转了促进作用，提示lncRNA TUG1 可负调控miR-145 促进Colo320 细胞的侵袭和EMT。研究显示，miR-590-5p、miR-3150b-3p 等miRNAs 在CRC 增殖和转移中发挥作用[19-22]。miR-145 是一种新发现的miRNA，肝癌患者血清miR-145 表达水平升高，可作为肝癌预后的评估指标[23]；miR-145 过表达增强宫颈癌细胞的辐射敏感性[24]。然而，miR-145 在CRC 细胞系或组织中的表达及其作用尚未被讨论。本研究重点探讨了miR-145 在Colo320 细胞发展中的作用，结果显示miR-145 在癌组织、Colo320、HCT116 细胞中表达下调，过表达miR-145 抑制了Colo320 细胞发展，与之前报道一致[25]。这为miR-145 在CRC 进展中的作用提供了新的证据。
KIAA1199 被定义为细胞迁移诱导蛋白，KIAA1199在许多癌症中过表达，并通过不同的信号通路促进癌症转移。Evensen 等[26]发现KIAA1199 在乳腺癌转移组织中上调，导致乳腺癌细胞发生EMT。然而，在Colo320 细胞中，lncRNA TUG1 可通过miR-145 上调KIAA1199 表达，且KIAA1199 siRNA 转染细胞后明显抑制癌细胞转移，提示KIAA1199 参与了CRC 的进展。
综上所述，LncRNA TUG1 通过miR-145 促进KIAA1199 表达，加速Colo320 细胞增殖、侵袭及EMT。TUG1 可能是治疗CRC 的一个潜在靶点。
