双酶显色-紫外-可见分光光度法测定牛奶中组胺与腐胺的含量

2022-01-19姚晓曈刘振民喻东威

理化检验-化学分册 2022年1期

姚晓曈 ,徐斐 ,叶泰 ,袁敏* ,刘振民 ,喻东威

(1.上海理工大学医疗器械与食品学院上海食品快速检测工程技术研究中心,上海 200093;2.光明乳业股份有限公司乳业研究院,上海 200436;3.内蒙古蒙牛乳业集团股份有限公司,呼和浩特 011500)

生物胺是一类具有生物活性并且相对分子质量小的含氮有机碱,由氨基酸在脱羧酶或氨基转移酶的催化作用下形成[1-2]。根据生物胺的组成,可将其分为单胺(如酪胺)、二胺(如组胺、腐胺等)和多胺(如精胺)。其中,组胺和腐胺常存在于发酵食品和水产品中[3-4]。摄入高浓度的组胺会引起眼结膜充血、头昏、恶心、胸闷等中毒症状,甚至会致人死亡;腐胺对眼睛、皮肤、消化道、呼吸道等有强烈的刺激作用[5]。由于生物胺的多样性和其对人体作用的复杂性,国际上还没有较为全面的生物胺膳食摄入评估数据。由于组胺的毒性强、分布广,目前多数国家对食品中组胺含量进行了规定,如欧盟要求水产品中的组胺质量分数不得超过100 mg·kg－1。但是,国际上尚未对乳制品中的生物胺提出限量要求。根据报道,乳制品中组胺质量分数为0.6～2.1 g·kg－1,腐胺质量分数为2.5 g·kg－1[6],因此有必要对乳制品中组胺和腐胺的含量进行监测。

目前,测定生物胺的方法主要有高效液相色谱法[7]、气相色谱法[8]、毛细管电泳法[9]、离子色谱法[10]等。这些方法精密度高、重复性好,但是存在以下问题:①需用到大型仪器、多种有机试剂,且操作复杂,专业要求高;②前处理时间较长,不利于现场检测;③成本较高,难以大范围使用。利用二胺氧化酶(DMO)对二胺类生物胺的催化反应测定其含量已有文献报道。文献[11]利用DMO 与磁珠结合的电化学方法测定组胺、尸胺的含量;文献[12]以DMO 为生物识别元件,以微流控芯片和化学发光分析仪为传感元件,以鲁米诺-铁氰化物为化学发光体系,采用生物酶传感器法测定腐胺、组胺的含量。

DMO 可与二胺类生物胺发生催化反应,生成的过氧化氢能够与辣根过氧化物酶(HRP)反应产生羟自由基使显色剂四甲基联苯胺(TMB)变为ox TMB(TMB的氧化态),溶液由无色变为蓝色,加入盐酸终止反应,溶液由蓝色变为黄色。利用上述DMO 和HRP的级联催化原理,本工作建立了基于DMO-HRP双酶显色的紫外-可见分光光度法快速测定牛奶中组胺和腐胺含量的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

TU-1901型紫外-可见分光光度计;QL-866 型旋涡混合器;WT100-3型恒温水浴锅。

磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4):0.2 mol·L－1,称取二水合磷酸二氢钠31.202 g,用水溶解并定容至1 L,获得A 液;称取磷酸氢二钠28.392 g,用水溶解并定容至1 L,获得B液。将A 液与B液按照体积比19∶81混合均匀,得到浓度为0.2 mol·L－1的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)。

组胺标准储备溶液:10 mmol·L－1,称取组胺11.115 mg,用磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)溶解并定容至10 mL,配制成浓度为10 mmol·L－1的组胺标准储备溶液。使用时,用磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)稀释至所需浓度。

腐胺标准储备溶液:10 mmol·L－1,称取腐胺8.815 mg,用磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)溶解并定容至10 mL,配制成浓度为10 mmol·L－1的腐胺标准储备溶液。使用时,用磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)稀释至所需浓度。

DMO标准溶液:1.0 g·L－1,称取DMO 0.005 g,用磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)溶解并定容至5 mL,配制成质量浓度为1.0 g·L－1的DMO 标准溶液。同法制备1.0 g·L－1HRP标准溶液。

TMB标准溶液:0.5 g·L－1,称取TMB 1 mg,用0.2 mL二甲基亚砜(DMSO)溶解,再加入1.8 mL水混匀,配制成质量浓度为0.5 g·L－1的TMB标准溶液。

所用试剂均为分析纯;试验用水为超纯水。牛奶购自某超市。

1.2 仪器工作条件

扫描范围400～600 nm;检测波长450 nm。

1.3 试验方法

移取10 mL牛奶,加入10 mL 2%(质量分数)硝酸铅标准溶液,搅拌均匀,得到硝酸铅质量分数为1%的阳性牛奶样品;再加入20 mL 0.1%(质量分数)三氯乙酸标准溶液,混合均匀,以转速7 500 r·s－1离心5 min,取上清液,用2 mol·L－1氢氧化钠溶液调节溶液pH 至7.2,得到待测样品溶液。

移取1.0 g·L－1DMO 标准溶液100μL,加入100μL待测样品溶液,于50℃水浴中反应15 min。反应结束后,取出,依次加入1.0 g·L－1HRP标准溶液50μL,0.5 g·L－1TMB 标准溶液200μL 和2 mol·L－1盐酸溶液50μL,观察溶液颜色变化,按照仪器工作条件测定体系的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 紫外-可见吸收光谱图

按照试验方法对0.2 mol·L－1磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)、50 μmol·L－1组胺标准溶液和50μmol·L－1腐胺标准溶液分别进行测定,结果见图1。

图1 紫外-可见吸收光谱图Fig.1 UV-Vis absorption spectrum

结果表明:仅磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)存在的情况下,体系在可见光区未出现吸收峰;当加入50μmol·L－1组胺或腐胺标准溶液后,体系在450 nm 处出现一个明显的吸收峰,并且在试验过程中,体系颜色发生了由无色到蓝色再到黄色的变化。据此,可建立基于DMO-HRP 双酶显色的紫外-可见分光光度法测定组胺和腐胺含量的方法。

2.2 反应温度的优化

由于组胺和腐胺具有相同的反应原理,因此本工作以组胺为研究对象进行条件优化。试验考察了反应温度分别为25,30,40,50,60,70,80,90℃时对体系吸光度的影响,结果见图2。

图2 反应温度对体系吸光度的影响Fig.2 Effect of reaction temperature on absorbance of system

结果显示:随着反应温度的升高,体系的吸光度呈先增大后减小的趋势;当反应温度为50 ℃时,体系的吸光度较大。这是由于反应前期,随着温度的升高,DMO 的活性逐渐增强;当反应温度过高时,DMO 的活性降低,催化反应被抑制,导致体系的吸光度减小。因此,试验选择的反应温度为50 ℃。

2.3 反应时间的优化

试验考察了反应时间分别为5,10,15,20,25,35,45,55 min时对体系吸光度的影响,结果见图3。

图3 反应时间对体系吸光度的影响Fig.3 Effect of reaction time on absorbance of system

结果显示:随着反应时间的延长,体系的吸光度逐渐增大;当反应时间为5～15 min时,体系的吸光度增大速率较快,这是由于DMO 与组胺在5～15 min内反应较为迅速;继续延长反应时间,体系的吸光度逐渐达到平稳。为了满足快速分析的需要,试验选择的反应时间为15 min。

2.4 TMB质量浓度的优化

试验考察了TMB 质量浓度分别为0.2,0.5,0.8,1.0,1.5,2.0 g·L－1时对体系吸光度的影响,结果见图4。

图4 TMB质量浓度对体系吸光度的影响Fig.4 Effect of mass concentration of TMB on absorbance of system

结果显示,随着TMB质量浓度的增加,体系的吸光度呈先增大后减小的趋势。造成这种现象的原因可能是TMB标准溶液中含有一定量的DMSO,DMSO 会导致DMO 失活,随着TMB 质量浓度的增加,DMSO 的浓度也随之上升,进而导致体系的吸光度减小。因此,试验选择的TMB 质量浓度为0.5 g·L－1。

2.5 选择性试验

由于牛奶中含有丰富的氨基酸,并且氨基酸的分子结构与生物胺非常相似,组氨酸和精氨酸通过脱羧作用和转氨基作用可形成组胺和腐胺,因此DMO 对组胺和腐胺的选择性十分重要。分别以200μmol·L－1的精氨酸、赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸溶液为研究对象,考察了上述氨基酸在DMO 作用下,体系在450 nm 处吸光度的变化,结果见图5。

图5 DMO 与不同氨基酸反应后的体系吸光度Fig.5 Absorbance of system after reaction between DMO and different amino acids

结果显示,精氨酸、赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸与DMO 反应后,体系的吸光度很小,而组胺或腐胺与DMO 反应后,体系的吸光度明显增大,说明DMO 对组胺和腐胺具有较高的选择性。

2.6 标准曲线和检出限

移取适量的10 mmol·L－1组胺或腐胺标准溶液,用磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)逐级稀释,配制成组胺浓度为0,2.5,10,20,30,40,50,70,90,100,120,150,200,250,300,400μmol·L－1,腐胺浓度为0,5,10,20,30,40,50,70,90,100,120,140,150,170,200,250,300,350,400μmol·L－1的标准溶液系列,按照试验方法对上述标准溶液系列进行测定。以组胺或腐胺的浓度为横坐标,其对应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线,线性参数见表1。

以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),结果见表1。