高精度胶束毛细管电动色谱法测定牛磺酸滴眼液中牛磺酸和羟苯乙酯的含量

龙莹莹,刘 婷,王庆伟,鲁 彦,许 旭

(上海应用技术大学 化学与环境工程学院,上海 201418)

牛磺酸是成熟视网膜中不可缺少的一种含硫氨基酸[1-3]。牛磺酸滴眼液主要用于由牛磺酸代谢失调引起的白内障治疗,也可用于急性结膜炎、疱疹性结膜炎、病毒性结膜炎的辅助治疗。由于滴眼液一般为多剂量包装,通常需要添加抑菌剂来抑制微生物生长[4],常用的抑菌剂为羟苯酯类化合物,如羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯等。《中华人民共和国药典》(2015年版)(简称ChP 2015)中规定眼用制剂中可以加入适量的抑菌剂,但是没有对添加量做具体限度。长时间过量使用抑菌剂,会对眼部带来上皮细胞损伤、免疫反应等安全隐患,因此需要对其含量进行控制。

由于牛磺酸的紫外吸收较弱,ChP 2015中其含量的测定方法为氨基酸分析法和柱后衍生高效液相色谱法,但柱后衍生步骤繁琐,且衍生反应要在聚四氟乙烯反应管中进行,对仪器的配置要求较高;除此之外,测定牛磺酸的方法还有高效液相色谱法[4-6]、自动电位滴定法[7]、分光光度法[8]等。另外文献中报道的滴眼液中抑菌剂的测定方法有高效液相色谱法[9-12]、气相色谱-质谱法[13]、超高效液相色谱-串联质谱法[14]等。胶束毛细管电动色谱法可以同时分离分析带电荷的离子成分与不带电荷的中性成分,可用于同时测定牛磺酸滴眼液中牛磺酸和抑菌剂羟苯乙酯的含量。

本工作利用高精度定量毛细管电泳仪,通过优化电泳分离、缓冲试剂等条件,建立了胶束毛细管电动色谱法同时测定牛磺酸滴眼液中牛磺酸和抑菌剂羟苯乙酯含量的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

qCETM-3010型高精度定量毛细管电泳仪,配紫外检测器、高压电源、注射泵、四通手动纳升级定量阀进样器及色谱工作站;TU-1901型紫外-可见分光光度计;Milli-Q 型纯水机。

混合标准储备溶液:称取适量的牛磺酸标准品和羟苯乙酯标准品,置于10 mL 容量瓶中,加入适量甲醇溶解,再用水稀释至刻度,经0.22μm 微孔滤膜过滤,配制成牛磺酸质量浓度为50 g·L－1、羟苯乙酯质量浓度为1 g·L－1的混合标准储备溶液。使用时,用水稀释5倍左右,需要时可加入适量硫脲(电渗流标志物)。

硼砂-硼酸缓冲液(pH 9.0):称取适量的十水合四硼酸钠和硼酸,用水溶解并定容至100 mL,配制成硼酸盐浓度为15 mmol·L－1的硼砂-硼酸缓冲液(pH 9.0)。

含20 mmol·L－1十二烷基硫酸钠(SDS)的硼砂-硼酸缓冲液(pH 9.0)的混合液:称取适量的SDS标准品,用硼砂-硼酸缓冲液(pH 9.0)溶解,配制成含20 mmol·L－1SDS 的硼砂-硼酸缓冲液(pH 9.0)的混合液。

牛磺酸标准品的质量分数为99%,羟苯乙酯标准品的质量分数为99%,SDS标准品的质量分数为99%;乙腈、甲醇均为色谱纯;十水合四硼酸钠、硼酸、硫脲均为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

带隔离槽的石英毛细管柱(内径75μm,总长度65 cm,有效长度45 cm);缓冲液为含20 mmol·L－1SDS的硼砂-硼酸缓冲液(pH 9.0)的混合液;分离电压－15 kV;检测波长210 nm;进样量10 nL。

使用新的毛细管柱之前,先用甲醇、0.1 mol·L－1氢氧化钠溶液、水、0.1 mol·L－1盐酸溶液等淋洗液依次冲洗毛细管柱各5 min,每次换淋洗液前需要用水进行过渡;活化结束后,再用缓冲液平衡毛细管柱10 min。

1.3 试验方法

移取牛磺酸滴眼液样品5.0 mL,加水定容至10 mL容量瓶中,超声混匀,经0.22μm 微孔滤膜过滤,取续滤液,得到待测样品溶液。

仪器开机后依次用0.1 mol·L－1氢氧化钠溶液、水、缓冲液冲洗毛细管柱,以保证系统的重复性和稳定性,再按照仪器工作条件进样分析,两次进样之间用缓冲液冲洗毛细管柱。测定结束后,用10%(体积分数)甲醇溶液对毛细管柱进行清洗。

2 结果与讨论

2.1 色谱分离行为

按照仪器工作条件对混合标准溶液、样品溶液和空白溶液进行测定,所得电泳图见图1。

图1 电泳图Fig.1 Electrophoretogram

结果显示,在该电泳条件下,各组分均能达到基线分离,且与电渗流分离效果良好。其中硫脲是一种不电离且不易进入胶束的中性物质,可作为电渗流标志物直观地表征电渗流的出峰位置,通过考察硫脲与待测组分的分离情况,有助于避免可能存在的中性杂质的干扰。

2.2 检测波长的选择

牛磺酸和羟苯乙酯在波长190～300 nm 内的紫外-可见吸收光谱图见图2。

图2 紫外-可见吸收光谱图Fig.2 UV-Vis absorption spectrum

结果显示:羟苯乙酯在210,254 nm 处均有紫外吸收;而牛磺酸的紫外吸收较弱,仅在200 nm 附近存在末端吸收。为保证牛磺酸和羟苯乙酯均有较好的信噪比,试验选择检测波长为210 nm。

2.3 缓冲液体系的选择

试验考察了磷酸盐缓冲液体系和硼砂缓冲液体系(硼砂、硼砂-硼酸、硼砂-SDS、硼砂-硼酸-SDS)对硫脲、牛磺酸和羟苯乙酯分离效果的影响。

结果显示:含有硼砂的缓冲液更适用于硫脲、牛磺酸和羟苯乙酯的分离,且基线稳定,但单独的硼砂体系中牛磺酸和羟苯乙酯的分离度难以达到要求;而当以硼砂-硼酸-SDS为缓冲液体系时,硫脲、牛磺酸和羟苯乙酯之间的分离度均能达到要求。因此,试验选择以硼砂-硼酸-SDS为缓冲液体系。

2.4 缓冲液浓度的选择

试验考察了硼砂-硼酸缓冲液中硼酸盐浓度分别为10,15,20,25 mmol·L－1时对硫脲、牛磺酸、羟苯乙酯迁移时间和分离度的影响,结果见图3。

图3 缓冲液浓度对硫脲、牛磺酸、羟苯乙酯迁移时间和分离度的影响Fig.3 Effect of concentration of buffer on migration time and resolution of thiourea,taurine and ethylparaben

结果表明:随着缓冲液浓度的增大,硫脲与牛磺酸的分离度越来越好,而牛磺酸与羟苯乙酯的分离度呈下降趋势,原因可能是当缓冲液浓度较高时,电流增大,引起焦耳热增加而降低柱效、增大基线噪声;当缓冲液浓度为15 mmol·L－1时,各待测组分的分离度、基线和峰形均能满足测定要求。因此,试验选择缓冲液浓度为15 mmol·L－1。

2.5 缓冲液酸度的选择

试验考察了缓冲液酸度(pH 分别为8.4,8.7,9.0,9.3)对硫脲、牛磺酸、羟苯乙酯的迁移时间和分离度的影响,结果见图4。

图4 缓冲液酸度对硫脲、牛磺酸、羟苯乙酯迁移时间和分离度的影响Fig.4 Effect of acidity of buffer on migration time and resolution of thiourea,taurine and ethylparaben

结果表明:随着缓冲液pH的增大,硫脲与牛磺酸的分离度逐渐增大,而牛磺酸与羟苯乙酯的分离度逐渐下降;并且在试验过程中发现,当缓冲液pH较低时,牛磺酸的峰形不对称,有明显的拖尾现象,柱效较低;当缓冲液pH 较高时,电流大,焦耳热现象明显;当缓冲液pH 为9.0时,硫脲、牛磺酸、羟苯乙酯之间的分离度较好,峰形较好,且基线平稳。因此,试验选择缓冲液pH 为9.0。

2.6 SDS浓度的选择

试验考察了含有不同浓度(10,20,30,40 mmol·L－1)SDS的硼砂-硼酸缓冲液(pH 9.0)对硫脲、牛磺酸、羟苯乙酯迁移时间和分离度的影响,结果见图5。

图5 SDS浓度对硫脲、牛磺酸、羟苯乙酯迁移时间和分离度的影响Fig.5 Effect of concentration of SDS on migration time and resolution of thiourea,taurine and ethylparaben

结果显示:当SDS浓度较低时,硫脲与牛磺酸的分离度较好,但牛磺酸与羟苯乙酯的分离度较低;随着SDS浓度的增加,牛磺酸与羟苯乙酯的分离度逐渐增大,但较高浓度的SDS 会使电流增大;当SDS浓度为20 mmol·L－1时,硫脲、牛磺酸、羟苯乙酯之间的分离效果较好,分析时间和电流大小合适。因此,试验选择SDS的浓度为20 mmol·L－1。

2.7 分离电压的选择

试验考察了分离电压为－8,－12,－15,－18 kV 时对硫脲、牛磺酸、羟苯乙酯的迁移时间和分离度的影响,结果见图6。

图6 分离电压对硫脲、牛磺酸、羟苯乙酯迁移时间和分离度的影响Fig.6 Effect of separation voltage on migration time and resolution of thiourea,taurine and ethylparaben

结果表明:当分离电压绝对值较低时,硫脲、牛磺酸、羟苯乙酯之间分离度较小,分析时间较长;当分离电压绝对值较高时,电流较大,产生的焦耳热影响柱效,且基线不稳,影响测定结果的精密度。综合考虑,试验选择分离电压为－15 kV。

2.8 标准曲线、检出限和测定下限

配制牛磺酸质量浓度为5.02,7.46,10.90,15.80,31.60,40.80 g·L－1,羟苯乙酯质量浓度为50,100,167,200,250,333 mg·L－1的标准溶液系列。按照仪器工作条件对上述标准溶液系列进行测定,以各目标物的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,线性参数见表1。

对标准溶液进行稀释,以信噪比(S/N)为3时的质量浓度作为检出限,以信噪比(S/N)为10时的质量浓度作为测定下限,结果见表1。

表1 线性参数、检出限和测定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.9 精密度试验

按照仪器工作条件对混合标准溶液连续测定6次,计算各目标物迁移时间和峰面积的相对标准偏差(RSD),以考查方法的日内精密度。结果显示,牛磺酸和羟苯乙酯迁移时间的RSD 分别为0.30%,0.30%,峰面积的RSD分别为1.5%,1.7%,表明本方法有较好的精密度。

按照仪器工作条件对同一溶液连续测定6 d,计算各目标物迁移时间和峰面积的RSD,以考查方法的日间精密度。结果显示,6 d内,牛磺酸和羟苯乙酯迁移时间的RSD 分别为1.2%,1.6%,峰面积的RSD 分别为3.5%,3.6%。

本工作在高精度定量毛细管电泳仪上配置纳升级定量阀进样器,改善了进样体积精度,配合使用毛细管温控系统,峰面积重复性RSD 通常小于2.0%[15-17],与普通的毛细管电泳仪(RSD 约3.0%或更大)相比,显著改善了定量的重复性。

2.10 回收试验

按照试验方法对实际牛磺酸滴眼液样品进行加标回收试验,每个浓度水平制备3个平行样(牛磺酸通过称重加标,羟苯乙酯通过标准溶液加标),计算回收率,结果见表2。

表2 回收试验结果Tab.2 Results of test for recovery

2.11 样品分析

按照试验方法对某制药厂生产的不同批次的牛磺酸滴眼液(牛磺酸标示量为50 g·L－1,羟苯乙酯标示量为0.25 g·L－1)进行测定,每个样品平行测定3次,结果见表3。

表3 样品分析结果Tab.3 Analytical results of samples

本工作采用高精度定量毛细管电泳仪,建立了胶束毛细管电动色谱法同时测定牛磺酸滴眼液中牛磺酸和羟苯乙酯含量的方法。该方法操作简单、分离效果好、精密度高,可用于牛磺酸滴眼液样品中牛磺酸和羟苯乙酯的同时测定。