超高效液相色谱-串联质谱法测定植物源性食品中丁氟螨酯及其代谢物的残留量

2022-01-19曹春梅王安宁邹晓川

理化检验-化学分册 2022年1期

路蕴 ,曹春梅 ,王安宁 ,邹晓川

(1.重庆化工职业学院,长寿 401228;2.重庆第二师范学院生物与化学工程学院,重庆 400020)

近年来,因大量使用农药而造成的食品安全事件频发[1-2]。农药虽然带来了巨大的经济效益,但也造成了严重的环境污染[3-4]。研究表明,农药代谢物对人体也有一定的毒性[5-6],并且检测到农药代谢物的几率要远高于其母体化合物[7-8]。丁氟螨酯作为一种新型杀螨剂,主要用于防治果树、蔬菜、茶叶等植物的害螨[9],与现有杀虫剂无交互抗性[10],对叶螨、全叶螨和植食性螨具有很强的杀灭作用,而对非目标生物和捕食性螨是安全的[11]。邻三氟甲基苯甲酸是丁氟螨酯的主要代谢产物,由硫代磷酸酯分解而成,具有一定的毒性,因此日本厚生劳动省对农产品中丁氟螨酯的限量要求包含其代谢物邻三氟甲基苯甲酸,需将邻三氟甲基苯甲酸的测定结果折算成丁氟螨酯的含量[12]。国家标准GB 2763－2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》规定丁氟螨酯在水果、蔬菜以及坚果中的残留限量为0.01～5.0 mg·kg－1。

液相色谱-串联质谱法因灵敏度高、选择性好而被广泛应用于食品中农药残留的检测[13-15]。另外,食品中含有大量的色素、生物碱、多酚、亲脂物等杂质,在测定过程中这些杂质会影响仪器的灵敏度,进而影响测定结果的准确性和重复性[16-18],因此如何有效地去除杂质并提取目标物是样品前处理的关键。固相萃取法(SPE)具有快速、稳定、方便、脂肪去除率高等优点,是一种高效、灵敏的多残留分析预处理技术,常用于去除样品中的多种杂质[19]。文献[20]报道以纳米材料为基质分散固相萃取剂,采用液相色谱-串联质谱法检测丁氟螨酯及其代谢物,但所用的纳米材料(如碳纳米管)价格昂贵,不适合推广使用。本工作采用普通石墨化碳黑固相萃取小柱,建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLCMS/MS)测定丁氟螨酯及其代谢物含量的方法,以期为食品安全监管提供可靠的技术参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Priemer型超高效液相色谱-串联质谱仪;Milli-Q 型超纯水器;XH-B 型旋涡混匀器;4001 型旋转蒸发仪;3-30k 型离心机;Organomation N-EVAP 111型氮吹仪;石墨化碳黑固相萃取小柱(0.5 g/6 mL)。

丁氟螨酯、邻三氟甲基苯甲酸单标准储备溶液:100 mg·L－1,分别称取0.01 g的丁氟螨酯、邻三氟甲基苯甲酸标准物质于一组100 mL 容量瓶中,用40%(体积分数,下同)乙腈溶液稀释至刻度,配制成质量浓度为100 mg·L－1的丁氟螨酯、邻三氟甲基苯甲酸单标准储备溶液,于0～4 ℃保存。

混合标准储备溶液:分别移取丁氟螨酯、邻三氟甲基苯甲酸单标准储备溶液各10 mL 于50 mL 容量瓶中,用40%乙腈溶液稀释至刻度,配制成丁氟螨酯和邻三氟甲基苯甲酸质量浓度均为20 mg·L－1的混合标准储备溶液。使用时,用40%乙腈溶液稀释至所需质量浓度。

丁氟螨酯标准物质的纯度不小于99.5%,邻三氟甲基苯甲酸标准物质的纯度不小于98.5%;乙腈、甲醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、甲酸均为色谱纯;盐酸为优级纯;乙酸铵、无水硫酸钠均为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱温35℃;流量0.2 mL·min－1;进样量10μL;流动相A 为乙腈,B为含0.2%(体积分数,下同)甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵溶液。梯度洗脱程序:0～2.7 min时,A 由40%升至80%;2.7～5.2 min 时,A 由80%升至100%;5.2～6.0 min时,A 由100%降至40%。

2)质谱条件电喷雾离子(ESI)源,正、负离子扫描模式(ESI＋、ESI－);多反应监测(MRM)模式;毛细管电压2.2 kV;离子源温度110 ℃,脱溶剂气温度350 ℃;锥孔气(氮气)流量50 L·h－1,脱溶剂气(氮气)流量600 L·h－1,碰撞气(氩气)流量0.35 mL·min－1;碰撞室压力0.53 Pa。其他质谱参数见表1。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

1.3.1 样品提取

称取样品4 g(茶叶1 g,加适量水浸泡0.5 h以上)置于50 mL具塞离心管中,依次加入90%(体积分数,下同)乙腈溶液10 mL、1 mol·L－1盐酸溶液1.0 mL、无水硫酸钠3 g和氯化钠2 g,用旋涡混匀器振荡提取2 min,以转速8 000 r·min－1离心3 min,取上层乙腈相(提取液)待净化。

1.3.2 样品净化

将提取液注入经5 mL 体积比为2∶3的丙酮-甲醇的混合液活化的石墨化碳黑固相萃取小柱中,立即收集流出液,再用6 mL体积比为2∶3的丙酮-甲醇的混合液洗脱,收集洗脱液,合并流出液和洗脱液,于40 ℃氮吹至近干,用2 mL 40%乙腈溶液溶解残渣,经0.22μm 有机系微孔滤膜过滤,滤液供UHPLC-MS/MS测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照仪器工作条件对20μg·L－1混合标准溶液进行测定,所得提取离子色谱图见图1。

图1 提取离子色谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms

2.2 提取条件的优化

丁氟螨酯和邻三氟甲基苯甲酸均能够溶于甲醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、正己烷等大部分有机溶剂,但由于邻三氟甲基苯甲酸在植物体内会与糖、蛋白质等物质结合,形成水溶性的糖配体复合物[21],因此提取剂须是一种能与水互溶的有机溶剂。综合考虑,试验选择提取剂为90%乙腈溶液。

由于邻三氟甲基苯甲酸的糖配体复合物在酸性条件下能够水解[22],因此在提取过程中需要加入盐酸。试验考察了不同体积(0.2,0.5,1.0,1.5,2.0 mL)的1 mol·L－1盐酸溶液对邻三氟甲基苯甲酸回收率的影响。结果显示,邻三氟甲基苯甲酸的回收率依次为67.0%,75.0%,89.0%,87.0%,90.0%;当盐酸溶液用量1.0 mL 时,邻三氟甲基苯甲酸可达到较高的回收率。因此,试验选择1 mol·L－1盐酸溶液用量为1.0 mL。

2.3 净化条件的优化

研究表明,石墨化碳黑、弗罗里硅土、C18对去除农药残留中的杂质具有较好的效果[19]。采用固相萃取柱,考察了石墨化碳黑、弗罗里硅土、C18等不同吸附剂对样品溶液净化效果的影响。结果表明,以弗罗里硅土和C18为吸附剂时,目标物的回收率在52.0%～75.0%内;以石墨化碳黑为吸附剂时,丁氟螨酯和邻三氟甲基苯甲酸的回收率达75.0%以上,样品净化效果较好。

以石墨化碳黑固相萃取小柱(0.5 g/6 mL)为净化柱,以体积比为2∶3的丙酮-甲醇的混合液为洗脱剂,考察了不同体积(2,4,6,8,10 mL)洗脱剂对丁氟螨酯和邻三氟甲基苯甲酸回收率的影响,结果见图2。由图2可知,当洗脱剂用量为6 mL 时,丁氟螨酯和邻三氟甲基苯甲酸回收率较高,因此试验选择洗脱剂用量为6 mL。

图2 洗脱剂体积对丁氟螨酯和邻三氟甲基苯甲酸回收率的影响Fig.2 Effect of volume of eluant on recovery of cyflumetofen and o-trifluoromethyl benzoic acid

2.4 色谱条件的优化

试验考察了不同流动相体系(甲醇-含0.2%甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵溶液、乙腈-含0.2%甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵溶液)对丁氟螨酯和邻三氟甲基苯甲酸分离效果的影响。结果显示:当以甲酸-含0.2%甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵溶液体系为流动相时,在梯度洗脱程序下,目标物无法完全分离;当以乙腈-含0.2%甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵溶液体系为流动相时,在梯度洗脱程序下,丁氟螨酯和邻三氟甲基苯甲酸均能够较好的分离,且峰形较好,因此试验选择流动相为乙腈-含0.2% 甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵溶液的混合液。

2.5 质谱条件的优化

采用注射泵直接进样的方式,在ESI＋和ESI－电离模式下进行一级质谱分析。结果表明,丁氟螨酯在ESI＋电离模式下的母离子丰度较大,邻三氟甲基苯甲酸在ESI－电离模式下的母离子丰度较大。在确定目标物的母离子后,采用子离子扫描方式进行二级质谱分析,对子离子进行优化选择,确定定量离子和辅助定性离子,通过优化毛细管电压、一级锥孔电压、二级锥孔电压、射频透镜电压、碰撞能量、质谱分辨率等参数,两种目标物的准分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大。优化后的质谱参数见表1。

2.6 基质效应

按照试验方法对不同基质样品进行提取和净化,得到相应的空白样品溶液。分别用空白样品溶液(S1)和40%乙腈溶液(S2)配制50μg·L－1混合标准溶液,按仪器工作条件进行测定,以两者峰面积比值来评估基质效应(ME)[23],结果见表2。

表2 基质效应Tab.2 Matrix effect

结果表明:丁氟螨酯在6种样品基质中均表现为基质抑制效应(ME＜100%);邻三氟甲基苯甲酸在大豆、甘蓝、苹果、绿茶中表现为基质抑制效应,在茄子、西红柿中表现为基质增强效应(ME ＞100%)。为避免基质效应的不利影响,试验采用基质匹配的混合标准溶液系列来绘制工作曲线。

2.7 工作曲线、检出限和测定下限

分别移取0.5,1.0,2.5,10.0,25.0μL 混合标准储备溶液,用不同基质的空白样品溶液稀释至1 mL,配制成丁氟螨酯和邻三氟甲基苯甲酸质量浓度均为10,20,50,200,500μg·L－1的基质匹配的混合标准溶液系列,按照仪器工作条件,对上述基质匹配的混合标准溶液系列进行测定。以各目标物的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制工作曲线。结果显示,丁氟螨酯和邻三氟甲基苯甲酸的质量浓度在10～500μg·L－1内与其对应的峰面积呈线性关系,线性回归方程和相关系数见表3。

以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果见表3。