脊髓背角NMDA受体NR2B亚基对舒芬太尼耐受形成的研究*

李智宇

黄河科技学院附属医院麻醉科，河南省郑州市 450000

舒芬太尼是一种强效的镇痛药，属于阿片类的镇痛药，是临床常用的一种麻醉药物[1]。舒芬太尼在阿片类药物中镇痛效应最强，尽管该药在临床上使用是安全的，但长期使用此类药物后，机体会对其产生耐药性，而为了减少疼痛，不得不加大用药剂量以达到与长期使用前类似的治疗效果，从而影响患者的疼痛控制及生活质量。近年来有研究表明，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体在中枢神经系统敏化及痛觉信号传导等过程中具有重要作用，可预防急性阿片类药物耐受的发生[2-3]。NMDA受体是离子型谷氨酸受体的一个亚型，在细胞增殖凋亡、信号传导及神经性疾病(如精神性疼痛)等机制中起重要作用。NMDA受体是由基本亚基(NR1)和调节亚基(NR2)组成的异四聚体或异五聚体[4]。而NMDA受体2B(NMDA receptor2B，NR2B)亚基是NR参与疼痛调节的主要亚基。有研究表明，NR2B过度表达在神经病理性疼痛的产生和维持方面起关键作用[5]。因此，本研究主要通过建立舒芬太尼耐受SD大鼠模型，分析脊髓背角NR2B亚基表达水平情况，研究舒芬太尼耐受形成的作用。

1 资料与方法

1.1 实验动物 选取40只SD成年雄性大鼠，SPF级(清洁动物)，大鼠体重为180～200g，均由湖南中医药大学动物实验中心提供。每只分笼圈养于动物中心实验室。饲养温度20～25℃，湿度50%～70%。适应性喂养1周后随机分为研究组与对照组，每组20只。

1.2 两组SD大鼠模型构建 对照组给予皮下注射0.9%氯化钠溶液(生产厂家：国药集团容生制药有限公司，规格：10ml×0.9g×5支，国药准字：H20044024)。2次/d，分别于8:00AM及20:00PM进行，共注射10d。研究组给予皮下注射舒芬太尼(生产厂家：宜昌人福药业有限公司，规格：5ml∶250μg×5支，国药准字：H20054256)建立舒芬太尼耐受SD大鼠模型。2次/d，分别于8:00AM及20:00PM进行，注射剂量为80μg/kg，共注射10d。

1.3 机械性刺激痛阈 分别于皮下注射前及皮下注射后第5天及第10天测量每只SD大鼠的机械性刺激痛阈。实验前将SD大鼠置于有机玻璃箱内，适应环境15min，使用弗雷纤维丝(VonFrey纤维)刺激SD大鼠后肢足底至SD大鼠后爪出现缩足反应为止，力量由轻至重，每只连续测量3次，每次持续3s，测量时间间隔10min，取其平均值记录作为每只SD大鼠的机械性刺激痛阈值。

1.4 热缩足反应潜伏期 分别于皮下注射前及皮下注射后第5天及第10天测量每只SD大鼠的热缩足反应潜伏期。实验前将SD大鼠置于辐射热测痛仪玻璃箱内，适应环境15min，调节光源与玻璃箱距离，观察SD大鼠的缩足反应，每只连续测量3次，每次持续20s，测量时间间隔5min，取其平均值记录作为每只SD大鼠的热缩足反应潜伏期值。

1.5 脊髓背角NR2B亚基水平 两组SD大鼠分别于皮下注射后第5天及第10天经上述检测后各取10只SD大鼠处死，取SD大鼠左侧脊髓背角(L4～L5)组织后提取总蛋白，将40μg蛋白加入样本中水煮，使其变性，完成后将其加入十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶中电泳，将其转膜至醋酸纤维素膜封闭2h。将NR2B和β-actin兔抗鼠多克隆抗体置于4℃环境下孵育，二抗常温孵育60min，利用化学发光试剂。与昏暗光线下曝光胶片，将其浸泡于显影液和定影液中。扫描条带吸光度，并对比蛋白相对含量。

1.6 脊髓背角NR2B mRNA水平 两组SD大鼠分别于皮下注射后第5天及第10天经上述检测后各取10只SD大鼠处死，取SD大鼠左侧脊髓背角(L4～L5)组织后提取总RNA，并逆转录成互补的cDNA模板扩增。NR2B mRNA基因引物：上游5’-TGGACAATTACYCCYCGACG-3’,下游5’-TCCGATTCTTCTTCTGAGCC-3’；β-actin基因引物：上游5’-ACTGCCGCATCCTCTTCCTC-3’，下游5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3’。条件设置：95℃5min，94℃30s，50～60℃退火30s，72℃40s，35个循环。完成后将其置入琼脂糖凝胶中电泳，扫描条带吸光度，并对比 mRNA相对含量。

2 结果

2.1 两组SD大鼠注射前后机械性刺激痛阈值对比 对照组注射前后机械性刺激痛阈值比较差异无统计学意义(P>0.05)；注射后第5天和第10天研究组机械性刺激痛阈值高于对照组(P<0.05)；研究组注射后第5天和第10天机械性刺激痛阈值均高于注射前，且注射后第5天高于注射后第10天(P<0.05)。见表1。

2.2 两组SD大鼠注射前后热缩足反应潜伏期值对比 对照组注射前后热缩足反应潜伏期值比较差异无统计学意义(P>0.05)；注射后第5天和第10天研究组热缩足反应潜伏期值高于对照组(P<0.05)；研究组注射后第5天和第10天热缩足反应潜伏期值均高于注射前，且注射后第5天高于注射后第10天(P<0.05)。见表2。

表2 两组SD大鼠注射前后热缩足反应潜伏期值比较

2.3 两组SD大鼠脊髓背角NR2B 亚基及mRNA水平对比 研究组注射后第5天和第10天脊髓背角NR2B 亚基及mRNA水平均高于对照组，且研究组注射后第5天脊髓背角NR2B 亚基及mRNA水平均低于注射后第10天(P<0.05)；而对照组注射后第5天和第10天脊髓背角NR2B 亚基及mRNA水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 两组SD大鼠脊髓背角NR2B亚基及mRNA水平比较

3 讨论

舒芬太尼是芬太尼的衍生物，主要作用于μ阿片受体，阿片类物质与阿片受体结合能有效改善患者疼痛[6]。有研究表示，在临床医疗及外科手术中，阿片类药物对抑制患者急慢性疼痛具有重要意义[7]。虽然舒芬太尼在缓解疼痛方面效果显著，无“天花板效应”，可持续增加剂量直至无痛，能让患者“忘记疼痛”，但同时也会产生耐药，降低镇痛作用。近年来诸多学者致力于研究阿片类药物的耐受机制，但有关舒芬太尼耐受研究较小。有学者发现，NMDA受体拮抗剂在抑制阿片类药物耐受的方面效果显著[8]。NR2B亚基是脊髓背角NMDA受体的重要组成部分，其结构和功能特征决定了NR2B参与神经病理性疼痛的发生、发展的病理过程[9]。因此，解析脊髓背角NMDA受体NR2B亚基对舒芬太尼耐受形成的作用，对临床减少或避免舒芬太尼耐受，提高镇痛效果十分重要。

目前临床认为，药物耐受的基础是机体长期使用或解除依赖性药物产生的代偿性适应[10]。而多数依赖性药物都能改变NMDA受体的表达和功能。NR2B亚基作为NMDA受体的重要亚基之一，在药物诱导精神依赖过程中起重要作用[11]。有研究结果发现，NMDA受体激活后可促进NO的合成，导致SD大鼠机械性刺激痛阈值降低[12]。本研究中，在研究组SD大鼠对舒芬太尼产生镇痛作用和痛觉过敏后持续给予舒芬太尼，其机械性刺激痛阈值较对照组显著增高，说明舒芬太尼对SD大鼠产生了镇痛作用，且随着连续皮下注射舒芬太尼的次数增加，SD大鼠对舒芬太尼产生了耐药，与既往多数研究结果一致，提示NR2B亚基与舒芬太尼耐受形成密切相关。本研究通过检测发现注射后第5天和第10天SD大鼠脊髓背角NR2B 亚基及mRNA水平升高，提示NR2B亚基表达水平与舒芬太尼耐受密切相关，说明舒芬太尼诱导大鼠耐受形成主要是通过促进脊髓背角NR2B 亚基表达水平增加，进而产生痛觉过敏。本次研究未探讨如何缓解舒芬太尼耐受形成，但既往有研究表示，可将NR2B亚基作为舒芬太尼耐受形成的治疗靶点，为临床改善急慢性疼痛提供方向[13]。

综上所述，舒芬太尼耐受形成与脊髓背角NMDA受体NR2B亚基表达水平升高有关，可将NR2B亚基作为舒芬太尼耐受形成的治疗靶点，为临床改善急慢性疼痛提供方向。