广东惠州地区609例血红蛋白Constant Spring的血液学与基因型分析

官志扬 陈迪娜 钟泽艳 贺海林 陈剑虹

血红蛋白Constant Spring（hemoglobin Constant Spring，Hb CS）是我国南方地区最常见的非缺失型α-地中海贫血（以下简称地贫）［1-2］。Hb CS是由于α2-珠蛋白基因第142 位的终止密码子TAA 突变为CAA，从而使生成的α 链比正常α 链延长了31 个氨基酸，合成了具有172 个氨基酸的α 链。该延长的α 链非常不稳定，易降解，从而使α 链减少，属地中海贫血样变异［3］。由于Hb CS 合并不同基因型时临床表征轻重不一，可表现为轻型、中间型甚至重型。惠州市位于广东省珠三角地区，常住人口达488 万人，是地贫的高发地区之一。本研究通过分析惠州地区609 例Hb CS 病例，总结其血液学表型和基因型之间的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2014年9月至2019年12月在本院进行地贫基因检测的患者共76 283 例（包括在本院就诊和惠州市辖县区医院就诊），选取其中明确诊断为Hb CS 的609 例患者作为研究对象，其中男237 例，平均年龄（27.26±8.37）岁，女372 例，平均年龄（26.18±7.51）岁。本研究获得本院伦理委员会批准，所有受试者及家属均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

日本希森美康公司XN-10 血细胞分析仪，法国Sebia 公司Capillarys 2 flex piercing 全自动毛细管电泳仪，厦门百维信生物公司Lab-Aid 824核酸提取仪，美国ABI 公司Veriti Dx PCR 扩增仪，美国Luminex公司Luminex Magpix 液态悬浮芯片检测仪。血常规及电泳试剂均为仪器配套；DNA 提取试剂盒购自厦门致善生物公司；核酸提取仪（DA Smart32 型）、全基因组DNA提取试剂盒、地中海贫血（α/β型）基因检测试剂盒均购自中山大学达安基因股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样本采集

采集待检者的静脉血两管（2 mL/管），一管以乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝，用于血常规分析；一管以酸性柠檬酸葡萄糖（ACD）抗凝，用于血红蛋白电泳分析及DNA 提取。

1.3.2 血液学分析

使用血细胞分析仪检测红细胞参数，主要观察指标为血红蛋白（hemoglobin，Hb）、平均红细胞体积（mean corpuscular volume，MCV）及平均红细胞血红蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）；使用全自动毛细管电泳仪分析血红蛋白组分及含量。其中，外院样本的血液学分析在当地县区医院完成。

1.3.3 DNA 提取

使用Lab-Aid 824 核酸提取仪和DA Smart32型核酸提取仪，配套使用相应的DNA 提取试剂盒提取全血DNA。

1.3.4 地贫基因分析

获取的全血DNA 采用地中海贫血（α/β 型）基因检测试剂盒，使用悬浮阵列技术进行地贫基因分析，具体实验步骤严格按照试剂说明书和仪器操作使用说明书进行操作。对罕见异常血红蛋白样本行α-或β-珠蛋白基因测序。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。计量资料以（）表示，采用One-Way ANOVA比较。计数资料采用n表示。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hb CS 的人群发生率及基因型构成比

在76 283 例样本中检测出Hb CS 609 例，人群发生率为0.798%（609/76283）。研究中共检出18种基因型，其中Hb CS 杂合子最多，占82.923%，Hb CS-H 病次之，占4.269%。见表1。

表1 广东惠州地区人群Hb CS 的发生率及构成比Table 1 The incidence and constituent ratio of Hb CS in Huizhou area of Guangdong Province

2.2 血液学参数结果

按基因突变类型分为5 组，分别为αCSα/αα组、αCSα/α+组、Hb CS-H 组、αCSα/αα，β0/ βN组和αCSα/αα，β+/ βN组，其血液学分析及其它基因型的血液学分析见表2。

经毛细管电泳分析，Hb CS 合并β 地贫杂合子样本均未检出Hb CS 波峰；Hb CS-H 病均检出Hb CS 波峰，且同时检出Hb H 或Hb Bart's 波峰；505 例Hb CS 杂合子样本中只有161 例检出Hb CS 波峰，检出率为31.9%，含量为0.3%～2.1%；部分新生儿虽未检出Hb CS 波峰，但检出Hb Bart's波峰。其它基因型Hb CS 波峰检出情况及含量见表2。

表2 不同类型基因型Hb CS 样本的血液学参数Table 2 The hematological parameters of Hb CS samples with different genotypes

2.3 基因型与血液学表型比较分析

因αCSα/αα，β+/ βN组只有3 例样本，不具代表性，故将以上划分的其余4 组基因型的血液学参数结果进行两两比较，各组间的Hb A2差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 4 种类型基因型Hb CS 样本的血液学参数比较分析Table 3 Comparative analysis of hematological parameters of Hb CS samples in four different genotypes

3 讨论

Hb CS 是α 地贫的一种特殊突变类型，其突变导致合成的Hb CS 链极不稳定，易被破坏。Hb CS杂合子在临床上可无症状，但当其合并其它不同地贫的基因突变时，临床表现存在较大差异。Hb CS纯合子表型各异，可以无明显血液学变化，也可以表现为Hb CS-H 病［4］，甚至可以表现为水肿胎［5-6］。

本研究共检出609 例Hb CS，人群发生率为0.798%，高于广东省平均水平（0.304%）［7］以及广州地区（0.338%）［8］、东莞地区（0.319%）［9］和肇庆地区（0.169%）［10］，略低于河源地区（0.881%）［11］。本研究共检出18 种基因型，各基因型的频率与以往广东地区人群的地贫基因频率的报道基本一致［7］。以Hb CS 杂合子为主，Hb CS 复合的α 地贫以--SEA为主，Hb CS 合并的β 地贫以βCD41-42和βCD17为主。

Hb CS 复合α+-地贫表现为轻型地贫，Hb CS-H病大多数表现为中度贫血，少数可表现为重度贫血。He 等［12］曾报道，Hb CS-H 病的胎儿出现水肿现象，表明Hb CS-H 病的临床表现存在个体差异。这可能是Hb CS-H 病不仅仅受α 珠蛋白基因突变的影响，还有可能受环境因素的影响。本研究中的两例Hb CS 纯合子均表现为轻度贫血，MCV 和MCH 正常或稍降低，而Hb CS 异常升高，均达到5%以上，与陈萍等［4］的研究一致。

Hb CS 合并β 地贫均表现为轻度贫血，Hb A2均大于3.5%，且均未检出Hb CS 波峰，呈现出β 地贫的血液学特征，而将α 地贫特征掩盖，与Jiang等［13］的研究结果一致。在两例再复合α+-地贫时，一例未能检出Hb CS 波峰，一例能检出Hb CS 波峰，但Hb CS 含量很低，只有0.4%，说明突变的α链和β 链得以重新保持相对平衡。有研究报道，Hb CS-H 病合并β 地贫表现为中度贫血，且能检出Hb Bart's［14］。而本研究的三例Hb CS-H 病合并β地贫均表现为轻度贫血，未检出Hb Bart's，但MCV 和MCH 都很低，说明Hb CS-H 病合并β 地贫可能是Hb CS-H 病导致α 链合成严重减少，而β地贫导致β 链合成也减少，缓解了α/β 链的严重失衡，在低水平保持相对平衡，也许正是如此，均未检出Hb H 和Hb Bart's。再者，三例的血红蛋白电泳结果中，Hb A2数值差异性大，一例＜2.5%，一例＞3.5%，一例正常且能检出Hb CS 波峰，含量为1.7%，表明Hb CS-H 病合并β 地贫患者存在明显的个体差异性，当突变的α 链和β 链能得以重新达到相对平衡，则能检出Hb CS 波峰。

值得注意，本研究中Hb CS 合并Hb New York表现为轻型地贫，而Hb CS 合并Hb J-Bangkok 以及Hb CS 复合αWSα 合并Hb J-Bangkok 均无明显血液学改变。Hb New York 和Hb J-Bangkok 都是β 链上突变形成的异常Hb。据文献报道［15］，单纯Hb New York 和Hb J-Bangkok 的表型正常，但本研究中似乎是Hb J-Bangkok 能平衡Hb CS 对血液学的影响，而Hb New York 无法平衡Hb CS 对血液学的影响。但这都是个案，需收集更多的样本进一步研究。Hb CS 合并Hb E 表现为轻型地贫（Hb121g/L，MCV77.8fL，MCH26.5pg），但在李友琼等［16］的研究病例中Hb CS 合并Hb E 表现为中度贫血，两个病例的血液学表现不一致，分析也许是前人的病例还存在有其他因素造成了贫血的加重。

因血红蛋白电泳能检出Hb CS，故常被用作Hb CS 的初步筛查。但本研究中，只有31.9%的Hb CS 杂合子能检出Hb CS 波峰，远远低于韦媛等［17］的研究。主要原因是，本研究大部分样本的地贫筛查数据来自于县级医院，而县级医院从事血红蛋白电泳检测的部分检验者未经进修学习，只会判读常规的血红蛋白及一些容易判读的异常血红蛋白（如Hb H 和Hb Bart's 等），而对于较难判读的异常血红蛋白的结果判读水平欠佳；或者是Hb A2降低，检验者认为该结果已经是地贫筛查阳性，常规建议行α 地贫基因检测，故将无把握判读的C 区域波峰删去；再者是由于毛细管老化，Hb CS 含量过低，系统未能自动读数，检验者容易忽略；从而造成很多在C 区域的波峰结果漏报。

综上所述，惠州地区是地贫的高发地区之一，Hb CS 发生率较高，本研究能在一定程度上补充该地区的流行病学数据。通过对该地区人群行婚前孕前地贫筛查，对筛查阳性者行地贫基因诊断，对夫妻同型地贫基因携带者行产前基因诊断，能有效减少重型地贫患儿的出生，从而减少出生缺陷。当Hb CS 合并其它地贫的基因突变时，临床表现有较大差异。本研究通过对Hb CS 的血液学表型与基因型分析，为临床医生提供遗传咨询提供参考，同时有助于完善惠州地区的地贫防控工作。