1例HIV/梅毒双窗口期共感染献血者的系统追踪

王立林 邬旭群 张耿 宁理 卢亮 刘晋洪 许晓绚 郑欣 左佳蕙 杨峥嵘 赵方 曾劲峰★

在过去的几十年里，梅毒的总发病率在全世界范围内都有所上升［1］。由于发病的高危人群与人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）一致（尤其是男男性接触者），梅毒HIV共感染病例较为常见。梅毒和HIV 共感染可相互影响单一病原体感染病毒学和免疫学反应过程，此外临床表现、临床诊断和疗效间的相互影响也存在争议［2］。理论上讲，一种病原体的感染可能会促进另一种病原体的感染并加速病程恶化。例如，梅毒可能通过生殖器溃疡来增加精液和阴道分泌物中的病毒载量，或通过降低CD4+T 细胞计数来增加个体对HIV 的易感性，从而促进HIV 的传播［3-4］。众所周知，梅毒可以成功治愈，早期发现HIV，也可达到临床治愈。但是，急性HIV 感染（Acute HIV-1 Infection，AHI）后早期抗病毒治疗（anti-retroviral therapy，ART）因为抑制特异性抗-HIV 抗体生成，减少HIV 抗原，降低病毒DNA/RNA 核酸浓度，会显著影响HIV 的检测［5-6］。本研究通过系统追踪，明确梅毒和HIV 共感染的窗口期患者经过早期治疗后，是否会影响早期免疫学、病毒学诊断结果及治疗效果。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 样本信息

深圳市血液中心无偿献血者，男，42 岁，汉族，工人，已婚，2018年4月6日（分别为第一次和第二次高危性行后41 天和35 天）在深圳市血液中心第19 次捐献全血。献血者问询及体检未发现异常及高危风险。本研究经深圳市血液中心医学伦理委员会批准，献血者已签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器

乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）（Murex，雅培公司，美国）；丙型肝炎病毒抗体（Human anti hepatitis C virus antibody，anti-HCV）（ORTHO，强生公司，美国）；第四代Genscreen ULTRA-HIV Ag-Ab 试 剂（抗-HIV1，Genscreen ULTRA，伯乐公司，美国）；第三代抗-HIV 试剂（抗-HIV2，北京万泰生物药业股份有限公司）；抗-TP 试剂1（DiaSorin S.p.A UK 分公司，英国）；抗-TP 试剂2（珠海丽珠试剂股份有限公司）。Procleix Ultrio Elite 检 测 试 剂，Procleix HIV-1、HCV、HBV Discriminatory Assay 鉴别试剂（Grifols，西班牙）；MPX v2.0 HBV、HCV、HIV（1+2 型）PCR-荧光法NAT 联合检测试剂（罗氏，美国）；Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 test，version 2.0（罗氏，美国）；人类免疫缺陷病毒（HIV 1+2 型）抗体检测免疫印迹法试剂盒（Western blotting，WB）HIV BLOT 2.2（MP 生物医学亚太私人有限公司，新加坡）。补充胶体金免疫层析法（上海科华生物股份有限公司）和胶体硒法Alere DetermineTM HIV1/2（雅培Alere Medical Co.Ltd.，美国），甲苯胺红未加热血清试验（tolulized red unheated serum test，TRUST，上海荣盛生物药业有限公司），梅毒螺旋体抗体血清试验（Treponema pallidum particleagglutination test，TPPA，富士株式会社，日本）；HIV-1 病毒DNA 检测试剂盒（天津精耐特基因生物技术有限公司）；HIV-1 病毒RNA 定量检测试剂盒（Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1，罗氏，美国）。

诺华全自动NAT 平台（PROCLEIX Tigris System，美国诺华）；CAP/CTM 系统［美国罗氏诊断公司cobass 201 核酸检测系统，由全自动混样仪（HAMILTON Microlab STAR IVD，瑞士HAMILTON），核酸提取仪（cobas AmpliPrep）与分析仪（cobas TaqMan），通过混样和数据管理服务器连接组成］；AutoBlot System 20 全自动免疫蛋白印迹仪（美国伯乐）；FACS Calibur 标准流式细胞仪测（BD Biosciences，San Jose，CA，美国）。

1.3 方法

1.3.1 样本保存

采集全血于EDTA 2K 管中。血浆和外周血单个核细胞在采集后6 h 内分离，-80℃分装冻存。

1.3.2 判定规则

操作方法和结果的判定均按照试剂说明书执行。标本均经3 遍酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），若2 遍及以上反应性最终结果判定为阳性，否则判为阴性。

1.3.3 核酸筛查

1.3.3 .1 NAT 单样本检测 样本定性检测献血者血浆中的HIV-1 RNA、HCV RNA 和HBV DNA；对初检单样本反应性的样本，再做NAT 鉴别检测。

1.3.3 .2 NAT 混样检测 模拟6 人份混样：取1份待测样本血浆5 份酶免核酸阴性血浆均匀混合；模拟12 人份混样：取1 份待测样本血浆11 份酶免核酸阴性血浆均匀混合，取混合样本血浆1 mL/份，进行MPX v2.0 PCR-荧光法NAT 联合检测。

1.3.4 HIV 病毒载量测定

具体操作严格按试剂盒说明书，最低检测限为20 copies/mL。

1.3.5 蛋白免疫印（western blottin，WB）迹确证实验

HIV BLOT 2.2 试剂说明书中结果判定标准：阴性——没有病毒特异带，或者只有p17 带；HIV-1阳性——检出2 条ENV 带（gpl60/gp41 和gpl20）及核心蛋白（GAG，包括p17、p24、p55）或酶蛋白（POL，包括p31、p51、p66）；不确定——出现任何特异条带，但不足以被判断为阳性。

1.3.6 HIV-DNA 定量分析

HIV-1 病毒DNA 检测整合到人类白细胞基因组中HIV-1 病毒DNA［7］。

1.3.7 CD4+T 细胞计数

应用标准流式细胞仪测定全血样本中CD4+T细胞计数。

1.3.8 追踪随访

在两年时间对窗口期献血者追踪随访11 次，采集其血样补充进口、国产HIV、梅毒抗体ELISA检测，HIV RNA 单人份、多人份混样核酸检测，HIV病毒载量检测，蛋白免疫印迹确证实验，HIV DNA定量分析及CD4+T 细胞计数。献血者在献血后28天开展HIV ART 治疗，49 天开展梅毒治疗。

2 结果

2.1 血清学检测结果

献血后第6 天，第4 代抗-HIV ELISA 和CLIA检测呈阳性。献血后第26 天，第3 代抗-HIV ELISA 和HIV 快速检测阳性。早期ART 治疗后，第4代抗-HIV ELISA 和CLIA 检测信号值略有下降。然而，第三代抗-HIV ELISA 和HIV 快速筛查试剂检测结果均未明显降低。HIV-WB 从献血后42 天开始呈阳性，WB 实验结果示意图见图1。在所有方法中，抗-TP 试剂1 ELISA 检测早期梅毒感染的效率最高。献血后第80 天，梅毒治疗后血清学TRUST 实验结果出现阴转。HIV/TP 共感染献血者治疗前后血清学、核酸学检测结果见表1。

图1 WB 实验结果示意图Figure 1 Schematic diagram of the WB experiment

2.2 HIV 核酸检测结果

献血者本次献血血浆，所有HIV 核酸检测方法均显示反应性。献血后第117 天，除6-MP NAT外，所有NAT 检测HIV-RNA 仍呈阳性反应。经过早期抗逆转录病毒治疗，献血后3 个月内，HIV RNA 病毒载量急剧下降，献血后246 天降至检出限以下；献血后403 天，外周血中仍可检测到HIV-1 DNA，见表1。

表1 HIV/TP 共感染献血者治疗前后血清学、核酸学检测结果Table 1 Serological and Nucleic acid test results after early treatment of HIV/TP coinfected blood donor

2.3 CD4 淋巴细胞计数与CD4/CD8 比值

急性感染期间CD4+T 细胞计数和CD4/CD8比值均显著下降。尽管在第345 天出现CD4+T 细胞计数和CD4/CD8 比值的轻微波动，经过ART 和青霉素治疗，免疫细胞下降的趋势得到较好逆转。见表2。

表2 CD4 淋巴细胞计数与CD4/CD8 比值Table 2 Trend of CD4/CD8 ratio after early treatment of HIV/TP coinfection

3 讨论

本研究通过动态追踪梅毒/艾滋病合并感染窗口期献血者，评估在梅毒/艾滋病联合感染并进行相应治疗前后，不同检测方法（血清学和核酸检测）的试剂诊断效能、机体免疫细胞的数量以及疾病治疗效果。

共同感染治疗后个体疾病进展通常都会改变［8］。之前的研究表明，HIV 引起细胞介导的免疫反应和体液免疫反应破坏改变了梅毒病程，艾滋病患者合并梅毒的临床进展通常比未感染该病毒的患者快［9］。梅毒治疗通常在合并HIV 感染者中应答率较低，表现为非螺旋体滴度下降较慢［10］。在本文病例中，梅毒治疗后，抗-TP 水平降低，并在第80 天时获得血清学应答。表明艾滋病毒/梅毒共感染的个体对梅毒治疗反应良好，尽管研究者不太确定HIV 共感染是否降低了应答率。本研究中不同试剂灵敏度不同，但受共感染影响不大。外生殖器溃疡（献血前第28 天）到抗-TP 试剂1、抗-TP ECLIA 和抗-TP 试剂2 血清学试验阳性之间的时间间隔分别出现在献血后0、6 和10 天。这些数据在单一感染梅毒患者出现症状的时间范围内［11］。梅毒治疗临床疗效需要监测非螺旋体抗体滴度，抗体转阴或滴度下降4 倍以上提示治愈。据报道，15%～25%的患者在初级阶段治疗2～3年后恢复到血清学无反应状态［12］。本研究中，梅毒治疗后血清学TRUST 实验结果出现阴转与之前的研究结果一致，即使在合并感染的患者中也是如此［13］。之前研究也通过比较感染和未感染艾滋病毒的患者，评估了梅毒治疗后艾滋病毒状况与血清学结果的关系［14］。但是，这些研究的结果并不一致，所以目前仍然不清楚艾滋病毒感染者是否能达到梅毒完全清除。这一学术争论的原因或许与①梅毒和HIV感染病程差异性相关；②对血清学无反应的定义不一致有一定联系。

根据英国性健康与艾滋病协会关于艾滋病毒窗口期（2014年11月）声明，暴露4 周后第4 代试剂检测结果呈阴性，艾滋病毒感染可能性极低［15］。然而，根据目前的结果，HIV 窗口期似乎在合并梅毒感染者中更长。本研究中，第四代抗-HIV ELISA 试剂和CLIA 检测试剂在献血后第6天呈阳性，距离献血前41 天和35 天高风险暴露已近6 周。因此推测，窗口期时间延长的一个可能原因是合并梅毒感染影响机体针对HIV 的体液反应进展。

2015年，世界卫生组织ART 指南建议，发现艾滋病毒感染后立即开展抗病毒治疗［16］。早期ART治疗及时降低HIV 病毒浓度。本研究中共感染献血者对ART 反应良好，说明了早期治疗艾滋病毒的重要作用以及HIV DNA 在共感染后作为病毒库长期存在。

根据献血者自述，献血前第28 天出现一处生殖器溃疡（下疳）。有研究表明，下疳通常在暴露后10～90 天出现［17］，原发性梅毒下疳形成后1～4 周是梅毒体液反应发展的窗口期［18］。本研究中联合感染对这一症状出现的时间影响似乎有限。

本例报告也存在不少局限性。首先，患者有两次高危行为，但由于缺乏更多信息，无法确定具体感染时间。其次，本研究主要集中在检测和治疗上，有关共感染对免疫系统影响的分子机制仍有待深入研究。后续将在更多不同阶段HIV 与梅毒共感染病人样本中，分析验证与免疫相关差异表达蛋白在不同病程中的功能，探明对HIV 窗口期抗体生成的影响。