黑豆肽对正常小鼠免疫调节功能的影响

2022-01-17李昱锟宋春丽

农产品加工 2021年23期

李昱锟，宋春丽，任健

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔161006；2.黑龙江省玉米主食工业化工程技术研究中心，黑龙江齐齐哈尔161006；3.黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006）

黑豆是营养价值很高的杂粮作物[1]，富含蛋白质[2]、纤维素及人体所需氨基酸，是我国极具开发潜力的特色植物资源[3-4]。近年来的研究发现，食源性蛋白肽具有抗氧化[5]、抗肿瘤[6]、免疫调节[7]等生物活性功能，且不会对机体产生毒副作用，受到了学者们的关注[8-11]。目前，植物源蛋白肽研究主要以玉米肽和大豆肽为主。有研究表明，玉米肽-锌螯合物可以提高细胞免疫和体液免疫功能[12]，大豆肽具有免疫调节作用[13]，能够显著促进人体淋巴细胞亚群的增殖，提高人体免疫能力[14]，而目前黑豆肽免疫调节相关的研究仍鲜有报道。因此，试验通过分析黑豆肽对正常小鼠的免疫脏器指数、血清中细胞因子、免疫球蛋白、脾淋巴细胞刺激指数等指标的影响来评价其免疫调节作用，以便为黑豆源免疫肽的开发提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

磷酸缓冲盐溶液（PBS）、刀豆蛋白A（concanavalin，ConA）、RPMI-1640培养液、MTT溶液（5 mg/mL）、胎牛血清，北京默飞生物科技有限公司提供；白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、ELISA检测试剂盒，上海江莱生物科技有限公司提供；雄性ICR小鼠，长春亿斯实验动物技术有限责任公司提供[生产许可证：SCXX（吉）2018-0007]。

1.2 仪器与设备

ME104E型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司产品；LXJ-2B型台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂产品；BPN-80CH型二氧化碳培养箱，天美科学仪器有限公司产品；Enspire型全波长多功能酶标仪，珀金埃尔默企业有限公司产品；UV5100型紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司产品；SW-CJ-1FD型超净工作台，上海暄泓科学仪器有限公司产品。

2 试验方法

2.1 黑豆肽的制备

调节黑豆蛋白分散液（10%，W/W）pH值至8.5±0.1，然后按照蛋白基添加碱性蛋白酶（4%，W/W），在60℃条件下反应70 min，反应过程中通过添加1 mol/L NaOH维持pH值恒定。反应结束后，反应物于90℃下灭酶10 min，然后快速冷却至室温，以转速4 000 r/min离心10 min，收集上清液，经喷雾干燥制得黑豆肽产品。

2.2 氨基酸组成分析

称取60 mg黑豆肽粉置于容积为20 mL的安瓿管中，加入6.67 mol/L HCl溶液9 mL进行酸水解，充氮封管后在110℃下水解24 h。用pH值2.2的柠檬酸缓冲液定容过膜，然后使用氨基酸自动分析仪进行分析。

2.3 试验动物分组与设计

健康的雄性ICR小鼠100只，饲喂标准饲料，室温24±2℃，相对湿度45%±3%，光照12 h/d，适应性喂养7 d后称质量，随机分为4组，正常对照组、黑豆肽剂量组（100，200，400 mg/kg·bw）。每日均在同一时间灌胃黑豆肽，且正常对照组小鼠每天给予等量的0.9%生理盐水溶液，连续灌胃21 d。

2.4 检测指标

2.4.1 免疫脏器指数测定

小鼠末次给药后，禁食12 h称质量，各组小鼠眼球采血后断颈处死，取脾脏和胸腺组织称量湿质量后按照公式（1）计算小鼠脾脏指数和胸腺指数。

2.4.2 血清中细胞因子和免疫球蛋白水平测定

连续灌胃21 d后，眼球采血处死小鼠，血样于4℃下静置2 h后，以转速4 000 r/min离心10 min，收集血清，按照ELISA试剂盒说明书检测血清中细胞因子（IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-6)和免疫球蛋白（IgA，IgM，IgG）的含量。

2.4.3 小鼠脾淋巴细胞体外增殖测定

在无菌环境下取小鼠脾脏，经研磨后通过200目筛网过滤，置于无菌PBS液中制成单细胞悬液。离心后将细胞沉淀置于3 mL裂解缓冲液中并轻轻振动2～3 min除去红细胞。用PBS液洗3次，每次以转速1 000 r/min离心5 min。调整细胞含量为3×106个/mL。将细胞悬液分为2孔加入24孔培养板中，一孔加75 μL ConA，另一孔作为对照，置于37℃，5% CO2培养箱中培养72 h。培养结束前4 h，每孔吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含胎牛血清的RPMI-1640培养液，同时每孔加入50 μL MTT（5 mg/mL），继续培养4 h，结束后每孔加入1 mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，然后分装到96孔板中，每孔做3个平行孔，用酶标仪于波长570 nm处测定[15]ConA刺激孔和细胞对照孔。结果按照公式（2）计算脾淋巴细胞的刺激指数。

2.4.4 小鼠NK细胞活力测定

取生长良好的Yac-1细胞，用含10%胎牛血清RPMⅠ-1640培养基调整细胞含量2×105个/mL，作为靶细胞应用液，备用。取上述制备好的脾细胞悬液50 μL加入96孔培养板中，细胞含量调整为1×107个/mL，作为效应细胞，将脾细胞悬液设6个复孔，其中3孔再加入50 μL靶细胞液作为试验孔，剩余3孔加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基作为效应细胞对照孔，另取6个复孔，分为3个靶细胞对照孔（50 μL靶细胞悬液+50 μL含10%胎牛血清RPMI-1640培养基）和3个空白对照孔（加入100 μL 10%胎牛血清RPMⅠ-1640培养基）。将培养板放至37℃，5% CO2培养箱中培养4 h后，每孔分别加入MTT（5 mg/mL）20 μL。再培养4 h，每孔加入酸性异丙醇100 μL，于5% CO2培养箱中放置过夜后，通过酶标仪于波长570 nm处测各孔光密度[16]。结果按照公式（3）计算NK细胞活力。

2.5 数据统计

根据统计学软件SPSS 22.0进行分析，数据采用X±s表示，p＜0.05具有显著差异，p＜0.01具有极显著差异，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析。

3 结果与分析

3.1 黑豆肽的氨基酸组成分析

黑豆肽氨基酸含量见表1。

表1 黑豆肽氨基酸含量/g·（100 g）-1

由表1可知，黑豆肽的氨基酸种类齐全，其中必需氨基酸占总含量的34.39%，支链氨基酸（BCAA）占总含量的14.59%。已有研究证明，支链氨基酸具有改善机体的营养及代谢的功能，可增强免疫功能[17]。表明黑豆肽具有增强免疫功能的作用。

3.2 黑豆肽对小鼠免疫脏器指数的影响

脾脏作为重要的淋巴器官之一，可广泛地参与到体液和细胞免疫调节当中。胸腺作为机体主要的免疫器官，对T细胞的成熟与分化起到一定的作用。因此，药物对脾脏指数和胸腺指数的影响可作为研究动物模型免疫机制的初步指标。

黑豆肽对小鼠免疫脏器指数的影响见图1。

图1 黑豆肽对小鼠免疫脏器指数的影响

由图1可知，与正常对照组相比，给予黑豆肽后，各剂量组小鼠的脾脏指数和胸腺指数虽有所增加，但差异无统计学意义（p＞0.05）。表明黑豆肽对正常小鼠的免疫脏器无明显影响。

3.3 黑豆肽对正常小鼠血清中免疫因子的影响

3.3.1 黑豆肽对正常小鼠血清中细胞因子含量的影响

细胞因子（Cytokine，CK）是免疫细胞的组织细胞所合成与分泌的小分子多肽。它能够调节机体的免疫应答和参与炎症反应。试验选用IFN-γ，IL-2，TNF-α和IL-6作为细胞因子的研究指标。IFN-γ和IL-2主要是由T淋巴细胞产生的[18-19]，可以增强NK细胞杀伤活性并促进吞噬功能[20-21]，而TNF-α和IL-6在细胞功能调节方面具有重要的作用，并参与炎症反应[22]和免疫反应[23]。

黑豆肽对正常小鼠血清中IL-2，IFN-γ，IL-6和TNF-α含量的影响图2。

图2 黑豆肽对正常小鼠血清中IL-2，IFN-γ，IL-6和TNF-α含量的影响

由图2可知，与正常对照组小鼠比较，黑豆肽剂量组小鼠血清中IFN-γ和IL-2的含量随着黑豆肽剂量浓度的增加而逐渐升高，但差异无统计学意义（p＞0.05）。而黑豆肽剂量组小鼠在灌胃剂量为200 mg/kg和400 mg/kg时，IL-6含量差异显著（p＜0.05），在灌胃剂量为400 mg/kg时，TNF-α含量也具有统计学差异（p＜0.05）。经黑豆肽干预后，刺激活化了T细胞、B细胞的增殖，分泌了抗体，并且与相应的受体结合，导致血清中细胞因子TNF-α和IL-6含量增加[24]，从而达到对机体免疫能力的调控作用。研究结果表明，黑豆肽对正常小鼠血清TNF-α和IL-6分泌具有促进作用，但是黑豆肽对IFN-γ和IL-2的分泌无显著影响。

3.3.2 黑豆肽对正常小鼠血清中免疫球蛋白含量的影响

免疫球蛋白在体液免疫中发挥着重要的作用，免疫球蛋白含量的大小可以反映出机体免疫能力的高低[25-26]，并且具有强大的杀菌和免疫调理作用[27]。

黑豆肽对正常小鼠血清中IgM，IgA和IgG含量的影响见图3。

图3 黑豆肽对正常小鼠血清中IgM，IgA和IgG含量的影响

由图3可知，与正常对照组小鼠相比，黑豆肽剂量组小鼠血清IgM，IgA和IgG含量分别增加了6.8%～8.6%，4.60%～16.62%和10.8%～20.5%。当黑豆肽灌胃剂量为200 mg/kg时，IgG含量具有极显著性差异（p＜0.01），IgA含量具有显著性差异（p＜0.05）；在400 mg/kg时，IgA含量具有极显著性差异（p＜0.01），IgG含量具有显著性差异（p＜0.05）；在灌胃剂量为100，200，400 mg/kg时，IgM含量具有显著性差异（p＜0.05），且随着剂量浓度的增加而升高。经黑豆肽的干预后，B细胞上的抗原受体与抗体相结合后，能够特异性的识别抗原分子，诱导免疫球蛋白含量增加，从而调控机体的免疫功能[28]。试验结果同样表明，黑豆肽可以提升免疫球蛋白的分泌能力，因此证明黑豆肽可以通过促进免疫球蛋白的分泌，达到增强机体免疫功能的效果。

3.4 黑豆肽对正常小鼠脾淋巴细胞增殖和NK细胞活力的影响

脾淋巴细胞中含有的T淋巴细胞是机体的免疫活性细胞，其增殖是反映细胞免疫最直接的指标[29]，而T淋巴细胞对ConA反应的大小可以反映出机体的细胞免疫水平。NK细胞是重要的免疫效应细胞，与机体的免疫调节能力有关[30]。

黑豆肽对正常小鼠脾淋巴细胞刺激指数和NK细胞活力的影响见图4。

图4 黑豆肽对正常小鼠脾淋巴细胞刺激指数和NK细胞活力的影响

由图4可知，与正常对照组相比，黑豆肽剂量组小鼠在200 mg/kg时脾淋巴细胞刺激指数有统计学差异（p＜0.05），在灌胃剂量为200 mg/kg时，NK细胞活力具有极显著差异（p＜0.01）；在400mg/kg时，NK细胞活力差异显著（p＜0.05）。当黑豆肽进入机体后，由于受到抗原的刺激，使T淋巴细胞与ConA反应增强[31]；NK细胞经过抗原活化，其表面分子对NK的杀伤细胞变得更敏感，从而使NK细胞含量得以提升[32]。试验结果同样表明，黑豆肽可以提升脾淋巴细胞刺激指数和NK细胞的活力，从而达到增强机体免疫功能的效果。