长链非编码RNA(lncRNA)核仁小RNA宿主基因7(SNHG7)对葡萄膜黑色素瘤癌细胞增殖和侵袭力的影响△

张 菡 高 彦 薛春丽 陈 涛

葡萄膜黑色素瘤是一种起源于葡萄膜的眼内原发性恶性肿瘤，早期症状不明显，多数患者确诊时已处于中晚期[1]，且易通过血流发生远处转移，约有一半的患者会出现肝脏转移，而且远处转移是导致患者死亡的主要原因[2]。尽管现有治疗方案不断进步和完善，但患者预后依然欠佳[3]。长链非编码RNA(lncRNA)是含有超过200个核苷酸但很少翻译为蛋白质的RNA，广泛存在于机体内，可通过对基因转录、蛋白翻译后修饰及表观遗传学等方面的调控参与多种病理生理过程[4]。近年来其在肿瘤发生与进展中的作用越来越受到重视[5]。核仁小RNA宿主基因7(SNHG7)是一种重要的lncRNA，在多种恶性肿瘤组织中均呈高表达，且与肿瘤增殖、转移等有关[6]。然而，其是否参与了葡萄膜黑色素瘤的发生与转移过程，鲜有报道。本研究探讨lncRNA SNHG7对葡萄膜黑色素瘤癌细胞增殖和侵袭力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料来源选取2011年8月至2019年8月在我院行手术治疗的葡萄膜黑色素瘤患者71例71眼作为葡萄膜黑色素瘤组，术前均未接受放射治疗或化学治疗，经病理学检查确诊。71例患者中,男41例，女30例，年龄24～75(46.7±11.5)岁；病理学类型：梭形细胞33眼，上皮细胞21眼，混合细胞17眼；右眼39例，左眼32例；肿瘤部位：睫状体25眼，脉络膜46例；出现巩膜浸润31眼。所有患者留取葡萄膜黑色素瘤组织标本，置于液氮中，-80 ℃保存。同期，选取因外伤摘除且葡萄膜完整、眼球正常的患者40例40眼作为正常组，取患者眼球组织行病理学检查以排除葡萄膜黑色素瘤，其中男26例，女14例，年龄22～77(47.1±12.8)岁；右眼24例，左眼16例，均置于液氮中，-80 ℃保存。正常组患者与葡萄膜黑色素瘤组患者性别构成、年龄、患眼眼别比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。本研究遵循《赫尔辛基宣言》所要求的伦理学原则，患者均签署知情同意书。

1.2 实时荧光定量PCR检测两组患者眼球组织中SNHG7表达取患者眼球组织，剪碎、冰上研磨，加入细胞裂解液，按试剂盒说明书步骤提取总RNA并检测其纯度。分别利用逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR完成逆转录及引物扩增。SNHG7：上游引物序列：5’-GCCCTGCAGCCTCGC-3’，下游引物序列：5’-CAGCGGCGCCTCCTC-3’；GAPDH：上游引物序列：5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，下游引物序列：5’-TTCTAGACGGCAGGTCAGGT-3’。反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，重复40个循环。每个样品设6个平行复孔。采用2-△△Ct法计算SNHG7相对表达量。

1.3 细胞实验部分

1.3.1 主要试剂和设备总RNA提取试剂(Trizol法)、Lipofectamine 2000试剂盒(美国Invitrogen公司)，逆转录和实时荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)，人葡萄膜黑色素瘤M23细胞(上海信裕生物科技有限公司)，DMEM培养液、胎牛血清、链霉素和青霉素(青岛捷世康生物科技有限公司)，CCK-8试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，Transwell小室(上海玉博生物科技有限公司)，Martrigel基质胶(美国BD公司)，StepOne实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。SNHG7引物序列由上海索莱宝生物科技有限公司设计合成，SNHG7干扰序列及对照序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。

1.3.2 细胞培养及处理将M23细胞置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中，放入37 ℃、含体积分数5% CO2的培养箱中培养24 h，用胰蛋白酶消化，传代培养。取对数生长期细胞，按Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行分组处理。(1)SNHG7干扰组：转染SNHG7干扰序列(正义链：5’-CCCAAGCTTCTCTGCGTGCGCCGGAGGCT-3’，反义链：5’-CCCGGGAACGTTTTCCATTCAAGACCAATTTA-3’)；(2)阴性对照组：转染阴性对照序列(正义链：5’-CCCAAGCTTGGGTGGCGAATTCGGCACGA-3’，反义链：5’-CATGCCATGGTGGTAAACCAAACCAATGATAAA-3’)；(3)空白组：不作任何处理。

1.3.3 实时荧光定量PCR检测细胞中SNHG7表达取各组转染后48 h的细胞，加入细胞裂解液，其余步骤同1.2。

1.3.4 CCK-8法检测转染后细胞增殖活性M23细胞用胰蛋白酶消化后接种于96孔板，每孔2×103个细胞，分组处理后，各组细胞分别于转染后12 h、24 h、48 h、72 h和96 h时，各孔加入CCK-8液20 μL，继续培养60 min。利用酶标仪在450 nm波长处分别检测各孔光密度(D)，实验重复3次。

1.3.5 Transwell法检测细胞侵袭能力用不含血清的DMEM液对基质胶进行稀释，取80 μL加入到Transwell 小室上室，过夜风干。取各组转染后48 h的细胞，用胰蛋白酶消化，沉淀后加入无血清培养液重悬，调整细胞密度为500×106个·L-1，取0.2 mL加入到小室上室，下室则加入0.6 mL含体积分数20%胎牛血清的培养液，培养48 h。用多聚甲醛固定，结晶紫染色，用棉签将散落细胞去除，镜下观察，随机取5个视野计数穿膜细胞数。

1.4 统计学分析应用SPSS 21.0统计学软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，两组间比较采用成组设计的t检验，多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 两组患者眼球组织中SNHG7表达情况葡萄膜黑色素瘤组患者眼球组织中SNHG7的相对表达量为2.05±0.16，正常组患者眼球组织中SNHG7的相对表达量为1.01±0.07，两组比较差异有统计学意义(t=39.461，P<0.001)。

2.2 葡萄膜黑色素瘤组不同临床指标患者眼球组织中SNHG7表达情况葡萄膜黑色素瘤组患者不同性别、年龄、肿瘤高度、病理学类型、患眼眼别、肿瘤部位和是否视网膜脱离眼球组织中SNHG7相对表达量比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)；而发生巩膜浸润和眼外生长的患者眼球组织中SNHG7相对表达量均较无巩膜浸润和无眼外生长的患者高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表1)。

表1 葡萄膜黑色素瘤组不同临床指标患者眼球组织中SNHG7表达情况

2.3 3组细胞转染后SNHG7表达情况转染后48 h，SNHG7干扰组细胞SNHG7相对表达量(0.27±0.09)明显低于阴性对照组(1.01±0.07)和空白组(1.03±0.09)(均为P<0.001)。

2.4 3组细胞转染后增殖情况CCK-8实验结果显示，与阴性对照组和空白组相比，SNHG7干扰组细胞转染后24 h、48 h、72 h和96 h时D均降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；培养12 h时，差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 3组细胞转染后不同时间D

2.5 3组细胞的侵袭情况转染后48 h，SNHG7干扰组侵袭细胞数为(89.77±9.82)个，显著低于阴性对照组[(133.14±7.54)个]和空白组[(137.09±10.05)个](均为P<0.001)(图1)。

图1 结晶紫染色显示转染后48 h 3组细胞侵袭情况

3 讨论

葡萄膜黑色素瘤癌细胞是一种增殖活性高、侵袭力强的肿瘤细胞，可经血流而转移至眼外其他组织或器官，在肿瘤早期阶段便可发生转移[7]，发生转移的患者死亡率在50%以上，癌细胞转移成为影响患者预后的主要风险因素[8]。然而，与葡萄膜黑色素瘤癌细胞增殖和转移相关的分子机制及敏感基因尚不确定。lncRNA是一类不编码或少量编码蛋白的RNA序列，可在表观遗传学、转录或转录后水平调控基因表达，从而参与各种疾病的发生及发展[4]。近年来研究发现，lncRNA与眼内恶性肿瘤的发生和恶化密切相关[9]。SNHG7作为一种lncRNA，位于人染色体9q34.3，在乳腺癌[10]、胃癌[11]等多种恶性肿瘤组织中均表达异常，且与肿瘤细胞增殖、侵袭密切相关。本研究结果显示，SNHG7在葡萄膜黑色素瘤患者眼球组织中的相对表达量高于正常眼球组织，说明葡萄膜黑色素瘤组织中SNHG7呈高表达，其可能参与了葡萄膜黑色素瘤的发病过程。此外，在发生巩膜浸润和眼外生长的患者眼球组织中SNHG7相对表达量均较无巩膜浸润和无眼外生长的患者高，说明SNHG7可能参与了葡萄膜黑色素瘤侵袭及转移过程。

Wang等[12]研究指出，SNHG7通过抑制P15和P16蛋白表达来促进胃癌细胞的增殖并抑制其凋亡。同时，SNHG7可促进食管癌细胞增殖[13]。本研究通过转染干扰序列的方法特异性下调M23细胞中SNHG7表达，结果显示，转染后48 h SNHG7干扰组细胞SNHG7相对表达量低于阴性对照组和空白组，说明SNHG7干扰组细胞中SNHG7基因表达被成功抑制。CCK-8实验结果显示，与阴性对照组和空白组相比，SNHG7干扰组细胞转染后24 h、48 h、72 h和96 h时D均降低，说明下调M23细胞中SNHG7表达可抑制细胞增殖，提示SNHG7可能参与了M23细胞增殖过程。Zhang等[14]研究发现，lncRNA SNHG7通过上调SOX4促进黑色素瘤细胞的迁移和侵袭。且SNHG7可加速宫颈癌细胞的侵袭与转移[15]。本研究结果显示，与阴性对照组和空白组相比，转染后48 h SNHG7干扰组侵袭细胞数显著降低，说明下调SNHG7表达可抑制细胞侵袭，提示SNHG7可能参与了M23细胞侵袭过程。

综上所述，葡萄膜黑色素瘤患者眼球组织中SNHG7呈高表达，且SNHG7高表达与肿瘤组织巩膜浸润和眼外生长有关，下调SNHG7表达可阻碍M23细胞增殖和侵袭，这可能为葡萄膜黑色素瘤发病机制及临床诊疗提供新的研究方向。